Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes
Summary
Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.
Abstract
La vaginosis bacteriana (VB) es un síndrome recurrente polimicrobiana que se caracteriza por un cambio en la "normal" microbiota de Lactobacillus dominado por una microbiota dominado por una serie de especies bacterianas, incluyendo Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginas, y 3.1 los demás. Esta condición se asocia con una serie de resultados negativos para la salud, incluyendo la adquisición del VIH 4, y puede ser difícil de manejar clínicamente 5. Además, el diagnóstico de vaginosis bacteriana se ha basado en el uso de la tinción de Gram de los frotis de hisopado vaginal que se califican en diversos criterios numéricos 6,7. Si bien este diagnóstico es sencillo, barato y bien adaptado a entornos con recursos limitados, que pueden sufrir de problemas relacionados con las interpretaciones subjetivas y no le da un perfil detallado de la composición de la microbiota vaginal 8. Los recientes esfuerzos de secuenciación profunda han revelado una microbiota rico, diverso, con la vaginaclaras diferencias entre las muestras tomadas de las personas que son diagnosticadas con BV en comparación con los individuos que se consideran normales 9,10, lo que ha dado como resultado la identificación de una serie de posibles objetivos para el diagnóstico molecular de la BV 11,12. Estos estudios han proporcionado una gran cantidad de información útil, pero la secuencia no es profundo y práctico como un método de diagnóstico en un entorno clínico. Recientemente hemos descrito un método para rápidamente el perfil de la microbiota vaginal en un formato multiplex utilizando oligonucleótidos, junto con la detección de perlas fluorescentes en una plataforma Luminex 13. Este método, como el actual la tinción de Gram basada en métodos, es rápido y sencillo, pero añade la ventaja adicional de la explotación del conocimiento molecular derivados de estudios de secuenciación en el diseño de la sonda. Por lo tanto, este método proporciona una forma de perfil de los microorganismos más importantes que están presentes en una muestra vaginal que se puede utilizar para diagnosticar BV con una alta especificidad y sensibilidad de un borradorared con tinción de Gram, mientras que el suministro de información adicional sobre la presencia y abundancia de especies de una manera semi-cuantitativa y rápida. Este método múltiple se puede ampliar mucho más allá del alcance de los actuales ensayos de PCR cuantitativa a organismos particulares, que actualmente se limita a 5 ó 6 pruebas diferentes en una sola muestra 14. Es importante destacar que el método no se limita a la detección de bacterias en muestras vaginales y pueden ser fácilmente adaptados al perfil rápidamente casi cualquier comunidad microbiana de interés. Por ejemplo, recientemente hemos comenzado a aplicar esta metodología para el desarrollo de herramientas de diagnóstico para su uso en plantas de tratamiento de aguas residuales.
Protocol
Discussion
La especificidad de la generación de la señal es de suma importancia, usted debe estar seguro de que la señal observada refleja realmente la detección de amplificación generados a partir de ese organismo. Software como PrimerPlex (Premier Biosoft) pueden ayudar a diseñar las sondas que se hibridan de manera eficiente, pero puede o no hibridizan a las especies no objetivo. Cuando universal de PCR se utilizan como se describe en este protocolo, es importante tener en cuenta que la amplificación generada representa …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Alberto Severini y Goleski Vanessa para ayudar con el desarrollo de ensayos y comentarios críticos sobre este manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Agencia de Salud Pública de Canadá y el Programa de Asistencia a la Investigación Industrial (National Research Council de Canadá). El apoyo adicional fue obtenida de la Universidad de Saskatchewan Fondo de Publicación.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
