Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3'UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

Introduzione I microRNA sono emersi come importanti regolatori dell'espressione genica che modulano l'attività di molti importanti processi biologici. Con più di 700 miRNA umane individuate finora 1, non è sorprendente che le mutazioni e la regolazione impropria di miRNA sono stati collegati a una varietà di disturbi fisiologici come il cancro e malattie cardiache 2,3. Recenti studi hanno dimostrato che la maggior parte dei miRNA siti di regolamentazione vincolanti, sono in 3'UTRs 4,5, e alcuni ricercatori hanno stimato che ci sono centinaia di obiettivi per miRNA nella cella 6. Data l'importanza biologica dei miRNA, il gran numero di miRNA che esistono e il gran numero di obiettivi per ciascuno di essi, è fondamentale che i ricercatori sono in grado di identificare in maniera semplice bersagli dei miRNA endogeni, preferibilmente su piattaforme suscettibili di high-throughput studi. Mentre utilizzando strumenti di calcolo come miRBase, TargetScan e PicTar 1,6,7 è un potente mezzo per generare liste di putativi mRNA target per qualsiasi miRNA, le previsioni non sono ancora sufficientemente accurata per essere fatta valere solo 8. Pertanto, i ricercatori leva anche una serie di approcci sperimentali per identificare gli obiettivi de novo o per convalidare obiettivi previsti. Molte squadre hanno fatto affidamento su high-throughput misure di steady-state i livelli di mRNA o proteina per identificare i geni per i quali cambia espressione quando l'attività miRNA è turbato 4,9,10. Tali cambiamenti sono senza dubbio biologicamente significative e rappresentano un primo passo importante, tuttavia misurando i cambiamenti nell'espressione generale non distingue tra effetti diretti di una miRNA in una trascrizione e gli effetti indiretti o di segnalazione a valle. Altri potenti strumenti che forniscono la prova diretta miRNA-mRNA interazioni sono cromatina-immunoprecipitazione (ChIP) strategie che cross-link Argonaute proteine ​​(e quindi il complesso RISC) di miRNA e mRNA, pur individuando i partner interagiscono non immediatamente indicano gli effetti funzionali di un evento così vincolante 5,11. Così, 3'UTR-reporter test che forniscono prove funzionali per effettuare un miRNA su un particolare UTR sono diventati una componente importante di uno studio approfondito miRNA. Tali cell-based dei dati di analisi insieme con le previsioni obiettivo computazionali o espressione e di proteomica dati dimostrano chiaramente che una 3'UTR particolare è direttamente regolata dal miRNA di interesse. In un 3'UTR-reporter test, il 3'UTR di un gene di interesse si fonde alla fine di un gene reporter luciferasi. Se il 3'UTR è un obiettivo di un miRNA, la stabilità trascrizione giornalista e / o la sua efficienza traduzione cambierà con variazione della concentrazione di miRNA funzionale. Quindi, a differenza di trascrizione di solo test basato, saggi reporter di aiutare a identificare gli effetti su entrambi mRNA stato stazionario e livelli di proteine. Reporter sistemi possono essere utilizzati anche per studiare gli effetti funzionali di mutagenizing un sito putativo miRNA vincolante in un 3'UTR per confermare che è davvero necessario per la interaction8. E mentre studi su larga scala l'utilizzo di matrici di espressione, le tecniche di proteomica, e ChIP Argonaute forniscono preziosi genome-wide dati per un piccolo numero di condizioni sperimentali, saggi di giornalista a base di cellule sono le più suscettibili di scaling up per lo studio dei microRNA-3 ' interazioni UTR in centinaia o migliaia di condizioni che dovessero rendersi necessarie per high-throughput screening di molecole di piccole dimensioni o altre librerie basate effettori. Molti scienziati hanno applicato la tecnologia di analisi giornalista allo studio dei miRNA-3'UTR interazioni. Tuttavia, con l'idea che i microRNA molte centinaia ogni bersaglio di diverse trascrizioni, è stato difficile per i ricercatori di utilizzare questo approccio potente su un high-throughput scala perché passi la clonazione, la validazione e l'ottimizzazione per la creazione di migliaia di differenti 3'UTR- vettori giornalista sono spesso dei costi proibitivi. Nel tentativo di fare piccole e grandi dimensioni 3'UTR-reporter studi accessibile a qualunque ricercatore, abbiamo creato un genoma raccolta di 3'UTRs umano clonato in pre-altamente ottimizzato sistema di analisi LightSwitch luciferasi. Il sistema include anche giornalista vettori di controllo convalidati, un insieme di oltre 700 costruzioni giornalista bersaglio miRNA sintetici da utilizzare come controlli positivi, e una serie di protocolli sperimentali standardizzati. Utilizzando il seguente protocollo, si può chiedere se un particolare 3'UTR umano è un obiettivo del miRNA di interesse. Le fasi critiche in questo flusso di lavoro sono disegno sperimentale, trasfezione di costrutti reporter e imita miRNA, saggi di luciferasi giornalista, e l'analisi dei dati. Per la progettazione sperimentale, è importante pensieroso selezionare una linea transfectable cellulare, costruisce giornalista sperimentale e di controllo, e mima miRNA e non-selezione dei controlli. Comune altamente transfectable adhlinee cellulari erenti come HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, e gli altri spesso funzionano bene con questo protocollo. Note importanti sul design sperimentale Il sistema di dosaggio LightSwitch luciferasi è un sistema giornalista completamente ottimizzato che include costruisce GoClone utilizzando il gene della luciferasi RenSP e reagenti LightSwitch luciferasi. Utilizzare tutti i componenti del sistema LightSwitch come raccomandato per ottenere risultati di test reporter. Co-trasfezione di oligo / plasmidi con Quadri costruisce giornalista GoClone riduce complessivamente i segnali luciferasi in modo non specifico modo. Pertanto, è importante eseguire le combinazioni di trasfezione seguenti: solo giornalista, reporter + non-targeting miRNA controllo e giornalista + miRNA specifici. Il nostro vettore empty_3UTR (promotore forte, non UTR) offre un altissimo livello di segnale luciferasi e serve come controllo positivo per l'efficienza di trasfezione, e un sintetico obiettivo vettore miRNA giornalista può servire come controllo positivo per imitare l'attività. Inoltre, si consiglia di utilizzare i comandi 3'UTR GoClone pulizia e controlli casuali per separare con precisione la sequenza-specifica vs effetti non specifici. Studiare il protocollo e, quando possibile fare Master Mix per diminuire la variabilità dei dati a causa di errori di pipettamento o evaporazione. Questo protocollo utilizza DharmaFect reagenti di trasfezione Duo (Dharmacon). Giorno 1 SUGGERIMENTO IMPORTANTE: Scegli la tua linea cellulare con saggezza. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare una linea cellulare che è noto per essere transfectable. Abbiamo anche trovato che la risposta misurabile di una 3 'UTR giornalista ad un miRNA imitare è attenuato in linee cellulari con alti livelli endogeni di quel particolare miRNA. Se non si sa quanto miRNA la tua linea cellulare esprime, prova a bersaglio sintetico microRNA SGG, che misura indirettamente l'abbondanza di un miRNA particolare in una cella, nonché informare l'utente circa la gamma dinamica della propria analisi. 1. Semi di cellule per produrre confluenza ≥ 80% al momento della trasfezione. Celle di semi in una piastra a 96 pozzetti bianco TC in 100μl volume totale. In parallelo, semi di un numero adeguato di cellule in una piastra chiaro a 96 pozzetti per la valutazione della confluenza. SUGGERIMENTO IMPORTANTE 1: Confluence è la chiave per ottenere buoni risultati in un esperimento imitare. Per knockdown ottimali, le cellule devono essere al 100% confluenti al momento della trasfezione. IMPORTANTE SUGGERIMENTO 2: Utilizzare le cellule passaggio basso per ottenere i migliori risultati. Le cellule che sono stati diversi passaggi troppe volte tendono a fornire dati di trasfezione rumorosi. 2 ° giorno Preparare costruisce GoClonereporter e miRNA, poi trasfezione nelle cellule confluenti. 2. Preparare Costruisce Scongelare costruisce GoClone (DNA plasmide) a temperatura ambiente. Mescolare bene. Centrifuga per rimuovere condensa dal tappo. 3. Preparare Micro RNA MicroRNA disgelo (imita specifiche e non-targeting controlli) a temperatura ambiente e centrifugare per rimuovere condensa dai tappi. Diluire a una concentrazione di lavoro di 2 mM in acqua RNase-free. Oltre a una miRNA sperimentale imitare sempre una non-targeting controllo miRNA. Co-trasfezione un plasmide e di un piccolo RNA oligo porta ad abbassare il segnale di trasfezione il plasmide da solo. Includere uno o più controlli positivi. Considerare l'utilizzo di una delle centinaia di vettori sintetici giornalista bersaglio miRNA nel catalogo della SGG. Includere uno o più controlli negativi o non specifici. SGG ha una serie di controlli tra cui UTRs 3 'di geni housekeeping, frammenti casuali e / o il vuoto (senza inserire UTR) di controllo. L'uso di uno o più di questi controlli a fianco una costruzione sperimentale vi permetterà di normalizzare eventuali effetti attribuibili alla sovraespressione del miRNA specifici o il controllo non-targeting non specifici. 4. Preparare trasfezioni Per ogni trasfezione combinare i seguenti reagenti per un singolo test: Miscela 1 Individuale GoClone giornalista: 3,33 microlitri microRNA: Varia * Senza siero media: a 10 L * Concentrazione efficace di miRNA può variare da 10 nM-100 nM. Consultare il produttore miRNA per la concentrazione adeguata. SUGGERIMENTO IMPORTANTE: non aggiungere troppo imitare. Una gamma ragionevole per simulare le concentrazioni di 10-50 nM è nella reazione finale 100uL. Eseguire almeno tre replicatrasfezioni te per ogni trattamento / combinazione UTR e comprendono il volume supplementare per consentire pipettaggio errore. Per esempio, moltiplicare i volumi di reazione solo del 3,5 per ottenere mix abbastanza trasfezione per 3 pozzi trasfezione replicare anche extra per pipettaggio errore o evaporazione. Per ogni giornalista, istituito replica per le seguenti: solo giornalista, reporter + non-targeting miRNA controllo e giornalista + miRNA specifici. Impostare trasfezioni per il microRNA targeting, allo stesso tempo quelli per un controllo non-targeting. Portare a DharmaFECT DUO (Dharmacon) miscela come segue per ogni trasfezione: Miscela 2 DharmaFect Duo: 0,15 microlitri I livelli di free media: 9,85 microlitri La quantità di DharmaFECT Duo da aggiungere può essere linea cellulare dipendente. Gli importi sopra indicati sono adatti per le cellule HT1080. Consultare la documentazione del produttore per determinare l'importo adeguato per la linea cellulare. Suggerimento: Fare una miscela di grandi dimensioni trasfezione moltiplicando i volumi sopra per il numero di giornalisti, il numero di repliche e il numero di miRNA da testare. Nel calcolare la quantità di miscela di trasfezione per preparare, essere sicuri di includere una piccola quantità in più per tenere conto di pipettaggio errori ed evaporazione. Lasciare il composto Duo DharmaFECT ad incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Dopo 5 minuti, aggiungere 10μL della miscela Duo DharmaFECT (Miscela 2) a ciascuna provetta preparato di 10uL plasmide e / o miRNA (miscela 1). Ogni tubo deve quindi contenere un volume di 20μL per trasfezione replicare. Incubare ciascun impasto per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, aggiungere 80 ml di pre-riscaldato (37 ° C), antibiotico-media liberi, completa per replicare ad ogni provetta per un totale di 100μL per trasfezione replicare. Un profondo pozzo blocco può essere utilizzato per la preparazione di molte repliche e campioni simultaneamente. Miscelare la soluzione pipettando su e giù. Rimuovere la piastra seminata dal termostato. Verificare che le cellule sono almeno l'80% confluenti. Con attenzione pipetta fuori i media da ogni pozzetto. Aggiungere 100μL della miscela di trasfezione (20 ul DNA / reagente mix + 80uL media) in ciascun pozzetto. Piastra posto in incubatrice durante la notte. Non troppo incubare. La maggior parte imita produrrà risultati significativi sulla buona fede obiettivi entro 24 ore. Il livello di repressione misurabile in 48 ore può essere maggiore, ma così il bene alla variabilità bene. Mimic esperimenti sono più facili esperimenti inibitore. Mentre la maggior parte imita in modo significativo reprimere i veri bersagli entro 24 ore, significative de-repressione attribuibili al inibitore può richiedere fino a 48 ore per essere misurabili e sarà quasi sempre meno pronunciata che l'effetto della mimica. 3 ° giorno Nota: saggi di luciferasi può essere effettuata immediatamente o le piastre possono essere congelati a -80 ° C (congelamento generalmente aumenta la lisi cellulare e il segnale luciferasi). Congelare e scongelare le cellule prima del dosaggio per i migliori risultati. RICORDATEVI di lasciare congelata scongelare le cellule a temperatura ambiente prima di aggiungere reagenti saggio LightSwitch. 5. Misurare l'attività luciferasi con AssayReagents LightSwitch Rimuovere la piastra da incubatore e portare a temperatura ambiente. Preparare reagenti LightSwitch (per kit LS010, protocolli di dimensioni altro kit si possono trovare online): Substrato ricostituire 100X con l'aggiunta di 100μL di substrato solvente al tubo del substrato saggio liofilizzato. Esporre alla luce e minimizzare i tempi a temperatura ambiente. Substrato 100X possono essere conservati a-20C per 2-3 settimane. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare substrato appena ricostituito. Preparare la soluzione di analisi sgelando bottiglia 10 ml di tampone del saggio in bagno d'acqua a temperatura ambiente ed aggiungere 100μL di substrato 100X ricostituito prima dell'uso. Mescolare bene. Utilizzare un pipettatore multicanale per aggiungere 100μL Soluzione Assay LightSwitch (buffer + substrato) direttamente al bene ciascun campione (contenente 100uL cellule + media) in un piatto bianco da 96 pozzetti. Se le cellule sono state coltivate in un altro piatto o formato fiasco, campioni trasferimento per un piatto bianco da 96 pozzetti in 100μL volume totale (media o PBS). Piastra di copertura, al riparo dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Se dosaggio più di un piatto, barcollare aggiunta di una soluzione di analisi in modo che ogni piatto incuba per 30 minuti prima della lettura. Leggi ogni bene per 2 secondi in un piatto Luminometer (SpectraMax L o equivalente). Calcolare la knockdown calcolando il rapporto luciferasi segnale per ogni costrutto per miRNA specifici sulla non-targeting di controllo (luminescenza = miRNA specifici / non-targeting di controllo). Utilizzare i dati di pulizie, casuale, e costruisce vuoto per controllare di non UTR effetti un trattamento specifico. Rappresentante Risultati Obiettivi 3'UTR in presenza di un miRNA targeting spettacolo knockdown luciferasi. L'atterramento di 3'UTR-luciferasi attività da giornalista let-7 è stata misurata in cellule HT1080 da co-trasfezione 100 ng di ogni giornalista costruire con 20Nm let-7a controllo imitare o non-targeting, incubando per 24 ore, poi leggendo il giornalista luminescenti segnale utilizzando reagenti luciferasi LightSwitch. Figura 1. 3'UTRs PUNC e ARID3B umani sono obiettivi del let-7 microRNA. Segnali provenienti dai cronisti 3'UTR umani a PUNC e ARID3B geni sono significativamente abbattute in presenza di let-7 microRNA imitano mentre i segnali per le pulizie e la sequenza casuale UTRs non lo sono.