Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

1. BTSC의 세포 분리 BTSCs는 neurospheres으로 혈청이없는 줄기 세포 매체에서 재배 기존의 문화에서 파생됩니다. 의 문화는 이전에 10, 11 설명되어 있습니다. BTSC – 파생 neurospheres에서 세포 현탁액을 준비합니다. BTSC – 파생 neurospheres로 15 ML 원뿔 튜브에 수집 된 5 분 900 rpm으로 centrifuged 있습니다. 빠른 원심 분리는 전단 및 / 또는 손상 neurospheres 수 있습니다. 표면에 뜨는이 흡입되어 neurosphere 문화는 사전 예열 Accutase의 0.5 ML에 resuspended 있습니다. 이 솔루션은 37 5-10분에 대한 incubated 수 있습니다 ° C neurospheres가 풀어야 할 수 있도록합니다. 셀은 기계적으로 10-20 부드러운 P100의 피펫의 스트로크 한 후 줄기 세포 매체의 1.5 ML은 Accutase을 중화하기 위해 셀에 추가됩니다으로 끝낼 수 있습니다. BTSCs 그 다음 5 분 1,300 rpm으로 centrifuged, 그리고 줄기 세포 매체 1 ML에 resuspended 있습니다. 50 μl 나누어지는이 suspens에서 제거됩니다이온은, 세포 계산을위한 microcentrifuge 튜브에 배치. trypan 파랑의 50 μl는 Eppendorf 튜브에 추가되고 정지는 셀 계산을위한 hemocytometer에 배치되어 있습니다. 셀 계산 한 후 필요한 경우 추가 줄기 세포 매체는 20000 라이브 셀 / μl 미디어의 셀 밀도를 제공 할 수있는 BTSC 정지에 추가됩니다. 2. 이중 계층 스와-8 마스터와 PDMS 스탬프의 성형 제작 (그림 1 참조) 우리는 마이크로 유체 장치의 조립에 필수적인 스와-8 마스터와 PDMS 스탬프를 조작하는 광학 리소그래피와 부드러운 리소그래피를 사용합니다. 표준 절차 12보다 약간 다른, 우리의 스와-8 마스터는 두 층으로 구성되어 있습니다. 250 μm 높이 퍼 뜨리고 및 수신 챔버 두 번째 / 상위 레이어에있는 동안 3 μm 높이 microchannels은 이전 과정에서 아래 / 첫 번째 층에 주조되어 있습니다. 이 문화 구획 (microchannel 사이의 올바른 연결을 위해서는s와 챔버), 두 레이어가 정확하게 위치에 정렬해야합니다. 그러나, 두 번째 층의 두께와 불투명도는 아래 기능을 액세스 광학 / fiducial aligner를 차단 할 수있을만큼 큽니다. 여기 fiducial 마커가 원격 위치하고있는 마스크를 디자인합니다. 두 번째 레이어를 회전하는 동안 따라서, 첫 번째 레이어에서 이러한 마커는 선택적으로 차폐 될 수 있습니다. 그 결과, 기능을 모두 레이어가 하나의 마스터에서 만든되고 PDMS 스탬프의 얕은 돋을 새김으로 성형 준비. 디자인 두 사진 마스크​​를 준비합니다. 한 마스크는 두 fiducial 마커와 첫 번째 층에 microchannels의 배열 (400 μm 길이 10-50 μm 폭)으로 구성되어 있습니다. 또 다른 마스크는 두 번째 레이어 챔버 (2mm 길이 600 μm 폭)을 퍼 뜨리고 및 수신 구성되어 있습니다. 두 마스크가 일러스트 레이터 (어도비, 캘리포니아)에 설계되어, 이소프로판올, 공기 건조로 청소 투명 필름 (얇은 금속 부품, 콜로라도)에 레이저 인쇄. 첫 번째 층과 만들기스와-8 포토 레지스트 (MicroChem, 매사추세츠) 공급 업체의 제품 설명서에 따라. 첫째, 스핀 코트 스와-8 (5)의 3 μm 두께의 포토 레지스트와 핸들 웨이퍼 (WRS 자료, 캘리포니아) 소프트 베이킹이 나타납니다. 포토 레지스트는 자외선 노출 후 베이킹 개발에 이어 가까운 접촉에서 해당 마스크와 치료 후입니다. 스와-8 (2100) 두께 250 μm와 스핀 코트 두 번째 층. 첫 번째 층에서 fiducial 마커를 차단에서 두꺼운 포토 레지스트를 방지하기 위해, 우리는 두 번째 층의 스핀 코팅하기 전에에 스카치 테이프로 이러한 영역을 다룹니다. 테이프 그런 다음 정렬 목적으로 마커를 나타 내기 위해 벗겨되어 있습니다. UV-노출 두 번째 마스크가 두 번째 레이어를. 정렬 마커가 발견으로, 그것은 광학 마스크 aligner를 사용하여 두 번째 마스크에있는 사람들에게 정렬 간단합니다. 포토 레지스트의 두 번째 층은 자외선 노출과 가까이 접촉에서 치료, 사후 제빵 및 개발에 이어 다음입니다. </ 리> 안티 – 스틱 코팅 된 마스터합니다. 치료 PDMS의 제거에 도움이되는 스와-8 마스터는 표면에게 nonstick 형 코팅을 할 수 증착을 통해 silanized 할 수 있습니다. 간단하게 trichloro 여러 드롭스 (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 진공 실란 솔루션으로, 적어도 하나의 시간 동안 건조기에 넣으십시오. 마스터와 PDMS을 본 뜨는거야. 성 예비 중합체베이스 철저히 10시 1분 비율로 PDMS Sylgard 184 (다우 코닝, 미시간)의 치료자를 섞는다. 공기 방울은 본 적이 될 때까지 진공 degassing을위한 건조기에 넣으십시오. 새로운 기포가 도입되는 경우 다시 마스크와 가스를 제거하다에 혼합물을 부어. 는 실내 온도에 냉각 한 후 90 C.에서 2 시간 동안 레벨 열판에 금형을 치료, 부드럽게 PDMS 스탬프를 놓습니다. 따라서, 배양 채널 PDMS에 새겨진 및 장치의 조립 준비되어 있습니다. 이 금이 간 또는 착용 될 때까지 마스터 성형 재사용합니다. 안티 – 스틱 코팅 끈적 거림이 회복되면 다시 수행해야합니다. 3.마이크로 유체 장치 및 세포 배양의 조립 (그림 2) 문화 셀 위해, 기능 조각 PDMS 스탬프는 동봉 된 채널을 형성하기 위해 유리 coverslip에 부착되어 있습니다. 유입구 및 유출구는 문화 / 미디어를로드하기 위해 생성됩니다. 한편, 청소 및 유리 기판과 PDMS 스탬프를 다른 절차는 셀 호환성을 보장하기 위해 필요합니다. 생검 구멍 구멍을 뚫는를 사용하여 PDMS 스탬프를 통해 저수지하십시오. 우리는 직경이 6mm로 선택합니다. 이 저수지는 두 목적을 위해 제공하고 있습니다. 하나는 세포 성장을위한 추가 영양을 보유하는 것입니다. 다른 하나는 피펫 로딩 및 진공 흡인의 액세스입니다. 30 분에 에탄올의 70 %에 PDMS 스탬프를 만끽 한 다음 다른 10 분에 드 이온화 물을 씻어. 목적은 제조 과정에서 도입하고, PDMS 오염을 uncrosslinked 잠재적 인 유기 잔차을 취소하는 것입니다. 이러한 유기 추출 13으로 더 강렬하고 철저한 청소 프로세스 </sup>와 Soxhlet 추출 (14) 다른 곳에서 사용되었다. 그러나, 우리는 BTSC 문화가 필요 발견했다. 압력솥 (121 ° C, 35 분)를 사용하여 PDMS 스탬프를 검사. 이 단계는 더 PDMS의 crosslink 반응을 완성합니다. 이 단계에서 시작하여 단계 3.6까지 모든 절차는 무균 방식으로 촬영하고 있습니다. PDMS 스탬프 그런 다음 이전에 폴리-L-라이신으로 코팅 된 유리 coverslip에 놓여 있습니다. 15-17 장치는 다음 37 번 박 laminin 솔루션과 채널 ° C.를 작성하여 laminin으로 코팅되어 있습니다 Laminin은 장치에서 흡입되고 장치가 줄기 세포 매체로 세척합니다. 저수지 및 채널에 1 단계에서 세포 현탁액을로드합니다. dissociated 세포 11 μl 한 심는 저장소에 배치됩니다. 진공 흡인이 필요한 경우, 시딩 챔버에 세포를 강제하는 데 사용됩니다. 셀의 추가 7 μl은 인접한 심는 저장소를 배치하고 있습니다. 참고 : 평균 셀 밀도는 20,000 세포 / μl 미디어입니다. 고물에어 5 분 심는 및 수신 저수지는 미디어와 물이 차고 있습니다. 상단에 0.5-1 mm 사전 autoclaved PDMS 시트를 놓습니다. 이 PDMS 조각 사이의 자연 – 발생 표면 부착은 세포 배양은 밀폐 및 운송, 부화 및 미세 이미지 준비 할 것입니다. 4. BioStation IM (니콘 인스트루먼트 Inc의, 멜빌, USA)와 BTSC 이주의 장기 시간 경과 영상. 카메라를 결합, 소프트웨어 및 보육 모든 한 상자 안에서,이 미세 시스템은 일없이 방해와 이미지 세포 배양에이 가능합니다. 또한, 독특한 모터 설계 목적 렌즈를 이동하고 포인트 방문 기능에 고정 샘플 단계를 유지합니다. 이 높은 처리량 분석에 이미지 병렬 실험을 추적 세포 운동하는 것이 실용적 수 있습니다. 사전 평형 온도, 수분, 공기 공급을 안정화시키기 위해 45 분 동안 Biostation의 IM합니다. 여러 물 cont의 추가샘플 챔버에서 ained 요리는 적절한 습도를 유지하는 데 사용됩니다. 현미경의 샘플 챔버에 휴대가 가능한 장치를로드하고, 센터는 마이크로 핀셋을 사용합니다. Biostation 소프트웨어의 초점, 위치 – 포인트 및 시간 포인트를 설정하고 시간 경과를 시작합니다. 5. 대표 결과 : compartmentalizing 마이크로 유체 장치를 사용하여 암 세포 이주의 육안 검사 및 특성의 예는 그림 3과 그림 4에 설명되어 있습니다. 세포 라인은 BTSC입니다. 현재 설치로는, 세포 배양의 위상 이미지는 지속적으로 오일 (그림 3)과 같은 긴 매 2 초 (그림 4)처럼 자주로에 대해 기록 할 수 있습니다. 오일 외에도, 문화 미디어가 삭제 영양 보충 및 폐기물에 대한 교체해야합니다. 우리의 장기 시간 경과는 형태학의 변화에​​ 근거하여 마이그레이션하는 동안 여섯 세포 단계의 회전 순서를 식별합니다. illus으로그림 3 trated, 우리는 (i) 사전 마이그레이션하고, (ii) 개시은 (III) 경로 – 탐험, (IV)가, (V) 대상 – exloration와 (VI) 후 이주를 주행로에 대해 설명합니다. 수신 챔버에서 스핀들 모양의 세포는 성장 나누어 점진적으로 마이그레이션 할 수 있습니다 대량 종양에서와 같이 무대은 (i)에있어. 그들은 microchannel 입구에 접근함에 따라, 몇 전지는 무대를 진행 (II)는 접착제 돌출부를 확장하고 생성 할 때. 그 중 하나가 입구를 점유하고 마이그레이션 방향을 탐색 할 수 무대 (3)으로 이동 할 수 있습니다. 셀 마이그레이션 방향을 결정하면, 그것은 전체 microchannel을 통해 수행됩니다 지속적으로 높은 속도에서 microchannel을 통해 크루즈에 (IV) 단계로 진행. 단계 (VI) 그 다음에 챔버를받은 열린 공간을 탐험하고,하는 단계 (V)에 microchannel, 셀 수익의 끝에서. microchannel에서 마이그레이션 전력은 대부분,도 4에 도시 된 바와 같이 활동을 blebbing하여 amoeboid cel과 비슷 생성리터. 셀 blebbing와 막 변형이 완전히 여기에 기록됩니다. 그림 1. 마이크로 유체 장치의 제조의 설계도. 전체 과정은 소프트 리소그래피의 수정 기술을 통해 3 인치 실리콘 핸들 웨이퍼에 수행됩니다. 3 μm 높이 microchannels 및 정렬 마커는 첫 번째 레이어로 구성되어 있습니다. 정렬 마커는 스카치 테이프로 가득하는 동안 다음 250 μm 두께 스와-8은 나중에 두꺼운 포토 레지스트에 의해 시력을 차단하지 않고 aligner를 마스크에 액세스 할 수 있습니다 것과 같은, 스핀 – 코팅입니다. 따라서, 챔버 기능은 두 번째 레이어로 만들 수하고 정확하게 첫 번째 레이어에 정렬. PDMS 스탬프는 결국 결과 마스터를 성형하고 있습니다. 그림 2. 장치 어셈블리 및 세포 심는 과정의 설계도. PDMS와 GL에 의해 둘러싸여엉덩이 coverslip은 3D 배양 공간이 챔버, 저수지 및 microchannels로 구성되어 있습니다. 수신 챔버가 처음 셀 – 무료 미디어로 가득되는 동안 시딩 챔버는 세포 배양으로 가득합니다. 그들 사이에 연결 microchannels는 측면을받는에 심는 측에서 셀 마이그레이션 길을 제공합니다. microchannel을 통해 그림 3. BTSC 마이그레이션. 어퍼 : 시간 ​​경과의 스냅 샷은 하나의 셀 (녹색으로 강조 표시) 시딩 측에서 수신 측에 400 μm를 통해 마이그레이션을 보여줍니다. 전체 여행은 세포 형태학의 변경 순서를 포함, 약 2 일이 소요됩니다. 규모 바는 40 μm이다. 밑으로 여섯 가지 마이그레이션 단계의 만화 표현합니다. 사전 마이그레이션는 (i) : 시딩 챔버에서 스핀들 – 모양 dividable 세포는 점차 서로 함께 마이그레이션. 전지 본체 및 전자 편광으로 서로 microchannel 입학 경주 근처에있는 세포 lamellipodia의 돌출부를 xerting. 가입 (II) : 경쟁이 후퇴하는 동안 최고 용량과 철새 셀 채널 입구에 자리 잡고 있습니다. 경로 – 탐구 (III) : 약간의 극성과 amoeboid 모드로 철새 셀 변경됩니다. 이 마이그레이션 모드는 매우 운동성 작은 ​​막 돌출부를 blebbing하여 모든 방향으로 경로를 탐색 할 수 있습니다. 크루즈 (IV) : 마이그레이션 경로가 결정되면, 세포 앞으로 제목 추가 큰 돌출부를 유지하여 적응 amoeboid 모드로 변환합니다. 이 방법은 셀은 높은 운동성뿐만 아니라 지속적으로 방향과 속도를지지. 대상 – 탐색 (V) : 경로 엔드시, 셀은 속도가 느려 및 공격 대상에 대한 수신 챔버를 둘러 filopodias을 개발하고 있습니다. 후 마이그레이션 (VI) : 수신 챔버를 입력 한 후 셀은 별 모양으로 변하기 높은 운동성 있지만 결정 방향을 유지합니다. "/> . (AB) : 시간 경과의 그림 4 스냅 샷은 BTSC의 활동과 막 변형을 blebbing의 사이클을 보여줍니다. 개시 (BD). 확장 (DF). 철회. 화살표와 곡선 – 라인 방향과 막 변형의 위치, 각각을 나타냅니다. 스냅 샷은 모든 팔초를 수집하고 있습니다.