FSL，构造一个简单方法修改细胞/病毒粒子表面的生物标志物的范围：在不影响他们的生存能力

以下协议描述插入FSL的构造（图1）生物膜的通用过程。简单的协议将仅是指细胞（kodecytes），在浓度为100％。然而，长期的细胞与病毒粒子（kodevirions）或生物体或细胞结构及其稀释剂的浓度互换并不重要，只要它总是在测试，控制和实验一致。与红血细胞，红细胞压积通常是80％，但与病毒粒子，胚胎和其他细胞，它通常小于1％。该方法是非常强大的，任何变化时，会产生改性膜，但将需要细化，优化和规范，修改为特定应用程序所需的程度。 1。 FSL的制备构造要准备FSL​​，构建原液第一次重组稀释液1.0mL（或在产品说明书中指定）除了产品小瓶干FSL的产品（见表1）。简言之超声（30秒）。这将准备一个1mg/ml的解决方案，它可以分装成100μL无菌容器和储存在2-8℃，最长不超过一周，或长达3个月冻结。 准备工作FSL，构建插入的解决方案，在使用前简要超声（30秒）原液均质任何胶束。需要在一定范围内，或如果需要的浓度稀释FSL，在缓冲构造（最好不要含有血脂或高疏水性材料）。 注： FSL的结构通常会插入细胞脂质包含媒体，但通常会要求一个更高的50X FSL的工作浓度比在PBS或其他脂质自由媒体。 工作范围内稀释，将取决于应用程序，检测方法灵敏度，FSL的构造类型和所需的修饰度。通常的稀释范围将介于10-500微克每毫升FSL的稀释剂碳水化合物FSL的结构和1-100微克/毫升，如荧光团和生物素等FSL，结构。 如果准备插入稀释液中含有多个FSL的构造，只需添加构造在他们正常的工作浓度相同的稀释剂。如果一个构建在浓度远高于另一个是，一些集中的调整（增加）可能需要较小的构造。或者可能被添加构造顺序，最好用浓度最高的构造，由较小。 FSL，构建超过1000微克/毫升的浓度可能会引入大量的脂质细胞膜，并可能改变细胞的形状，或使其更容易溶解。 FSL的构建工作方案应储存在2-8℃，并在几天之内使用。 FSL的结构可以在水稀释，但会减少的稳定，必须在几个小时内使用。如果包插入指定的重组稀释剂的水在瓶的产品也将包含盐（包中插入指定）。 2。插入膜FSL的构造（S） 先洗未绑定血脂FSL修改免费的细胞离心，洗涤液PBS或脂细胞介质。 包中的细胞或暂停在100μL稀释液。 同时准备控制理想情况下应该是双方未修改细胞孵育，用PBS，而不是FSL的解决方案和/或修改与FSL，构建一个良性的，但相关细胞。 加入100μLFSL的解决方案（包含1个或多个FSL的构造）适当稀释细胞1-2个小时，在37 ° C。 6小时孵化获得了类似的结果可以通过在25 ° C或过夜（18小时）在4 ° C – 混合建议每隔几个小时，如果使用沉重的细胞悬浮液。 清洗（可选）用PBS或媒体的两倍，以消除任何自由FSL的构造和准备适当的悬挂。 注： 可以暂停细胞的稀释剂细胞培养基，PBS，细胞的存储解决方案等，但最好不脂类（如胎儿小牛血清）或清洁剂（如吐温）。 可以使用不同的卷（超过100μL）的比值（大于1:1细胞/ FSL的解决方案）或孵育时间和温度条件，提供相同的比例，浓度和体积，用于获得可重复性的结果。 3。处理和可视化一旦FSL，修改过程中已经完成了kodecytes可以存放在4-8 ° C脂质自由媒体或使用。 Kodecytes和kodevirions一般行为未修改细胞/病毒颗粒相同，可handl教育署和在正常测试系统（显微镜，血清学，流式细胞仪等）来看。他们通常有没有特殊的要求，除了避免溶剂/清洁剂/血脂可能洗脱从细胞膜的脂质结构。 注： 结构仍将在不活跃的细胞，如红细胞，膜，如果储存在细胞的寿命脂自由媒体。积极膜细胞内的构造和代谢的速度依赖于细胞膜活动。 死细胞通常会包含FSL，结构的高层次，这可以用来从活细胞中分离出来的自生能力的细胞。 如果kodecytes存储（ 或体内 ）的脂质包含媒体/血清/血浆的构造，如环境，会慢慢从膜上洗脱过了几个小时或几天内，取决于温度和血脂浓度/成分。 4。代表结果： 以下代表的结果取决于构造（见表1），其插入的浓度和检测系统（S）的相对灵敏度和特异性。一般情况下，所有FSL的结构将插入细胞后1小时，但每一种情况的最佳条件，将需要建立。 FSL的结构可以用来标记一个活细胞的各种 3-9,11,14外。在如图所示的例子中，被用来在不同阶段的胚胎（因为他们是一个脆弱的细胞），但其他细胞（图3）或笼罩病毒颗粒（图4）也可以被标记。 FSL荧光素可以直接表面的标签（图2-4），而FSL抗生物素蛋白和其他FSL的结构可能需要一所中学的检测系统（通常是抗生物素蛋白/抗体/凝集素）的使用，以显示他们的存在（图5） 。 血型的人类或动物的特异性标记，可以附着到细胞，包括红细胞 4-9（图6） 。由于FSL的金额上kodecyte兴建的可控性和重现性好4-6，抗体定量kodecytes可（见表2和图6）。细胞的实际来源并不重要，他们可以是任何物种，甚至同一产地的源抗体，从而确保唯一不相容的抗原是由FSL 7,8（图6）介绍。 表2。测试代表了三种不同的FSL – A（三）红细胞kodecytes的血清学反应的单克隆抗- A稀释。与同等体积的O型红细胞孵育FSL – A（三）50微米的解决方案产生了强烈的抗原阳性细胞，这可能是由单克隆抗- A 1:512稀释检测。 5 – 10倍低FSL – A（三）解决方案的生产与少血型A抗原的表达kodecytes。 图1。FSL构造概述。像花一样FSL的结构由三个主要部分组成组成。功能头（F）中的固定利差贷款结构的情况下可以是各种不同的生物功能群体，远离膜诱导的F间距，提高水分散性和血清非活性间隔（S），而酰基脂质允许建构自发地纳入表面。 （一）FSL – GB3与血型GB（或P K）三糖抗原表位Galα4Galβ4Glcβ。 （二）FSL – A（三）与血型一个三糖抗原表位GalNAcα3（Fucα2）Galβ。 （三）FSL荧光素。 （四）FSL抗生物素蛋白与一个单一的生物素F基团。 I – III结构功能组结合dioleoylphosphatidylethanolamine激活己二酸衍生物（DOPE），而第四结构的间隔是基于carboxymethylglycine -己二酸。 图2。FSL荧光素标记的小鼠胚胎。所有图像都被打成当他们透明带（ZP）是完整的（即FSL的构造通过ZP标签内的胚胎通过）的活胚胎。图片我的四酸tyrodes FSL荧光素后标签从他们ZP发布的ZP – 胚胎。相同的染色发生时，不管是否胚胎FSL，与ZP完好或ZP免费修改。胚胎直接与FSL荧光素标记，2小时37℃，在无血清细胞培养基的方法，洗净，然后在荧光显微镜下观察。 （一）ZP自由两个细胞的小鼠胚胎，也呈现出经典的激烈极体染色。 （II – III）ZP免费四单元和8个细胞的小鼠胚胎细胞奏阴影，既显示染色IDE显微镜平面。 （四）ZP免费16细胞的小鼠胚胎。 （五）ZP完整的小鼠囊胚的胚胎（D4 – D5）胚胎和卵被标记。 图3。FSL荧光素和斑马鱼14。 （一）Microangiography 52 HPF（小时受精后）斑马鱼幼虫直接注入流通与FSL荧光素。斑马鱼的血管染色。 （二）FSL荧光素异构斑马鱼的肾组织细胞（ZK kodecytes）创建了体外，然后进入流通的52 HPF收件人斑马鱼微注射的ZK kodecytes体内观察注射后2小时的成像与时间推移显微镜下的荧光血管。显示的是一个大的滞销或不动的细胞（橙色箭头表示）和快速移动的细胞（由于运动模糊图像 – 绿色箭头指示）的单个视频帧。标签允许在体内的行为和生物分布的ZK kodecytes观察实时。 （三）FSL荧光素口服摄取实现沉浸在FSL -荧光斑马鱼的胚胎中含有长达5天的媒体。洗衣机是通过媒体没有固定利差贷款的结构（至少6个小时是必需的，但可以几天）的胚胎转移到。 （IIIA）FSL荧光素处理后的斑马鱼相应相邻的荧光图像（IIIB）明场显微镜。优先设在肠道中的荧光。在未经处理的控制胚胎（IVA和IVB）无染色观察。 图4。FSL – 10 VSV的病毒粒子和H1N1荧光标记。 （一）水泡性口炎病毒（VSV）是直接与10微克/毫升2小时FSL荧光素标记在37 ° C，4％多聚甲醛，然后流式细胞仪固定。没有净化VSV的kodevirion后FSL标签是必要的。 （二）kodevirions使用FSL荧光素标记流式细胞仪检测与人类/波多黎各Rico/8/1934（H1N1）感染的猪睾丸细胞。被视为未受感染的细胞的黑线，而融合的细胞在荧光细胞（红色线）与ST的H1N1 kodevirion。 图5。FSL，生物素标记的细胞，并通过标记的抗生物素蛋白7,8随后的可视化。所有细胞与FSL -生物素标记在37 ° C为1小时，洗净，然后与标记的抗生物素蛋白的荧光团，水洗和湿装荧光显微镜反应。 （一）编制一个小鼠胚胎囊胚共聚焦图像。 （二）中央焦片的胚胎从前面的形象。 （三）现场能动的人类精子 – 模糊作为其运动的后果发生。 （四）固定（4％多聚甲醛后插入）人类精子。 （五）人红细胞。 （六）固定（4％多聚甲醛前插入）RL95人类子宫内膜癌。 （七）不固定的RL95子宫内膜人类癌细胞系。 （八）（VIIIA），光学显微镜下观看了现场后2小时kodecytes静脉滴注（VIIIb）是同一领域，在荧光看，确定两个kodecytes目前在该领域所采取的血液样本中观察到的生物素红细胞kodecytes的视图。 kodecytes未标记的细胞比例计算，可使用作为一个生存的指标。 （九）现场可视化人体子宫内膜的生物素kodecytes结合avidinylated珠。 如图6。FSL碳水化合物添加血清分析血型标志。 （一）人类红细胞Galili kodecytes创建一个FSL – Galili浓度（500微克/毫升）和对人体血清稀释测试。人类红细胞不自然地发生xenoantigen Galili抗原。这种kodecytes可用于血清中抗体定量水平。在这个例子中，捐助者，被确定为反Galili滴度1:32。 （二）通过建立与量的日益减少的固定利差贷款（“抗原抗体滴度”），最佳抗原水平kodecytes检测抗体可确定（在这个例子中乐一个 ）。细胞可以创建只给予了积极的结果，当抗体水平超过某个特定的滴度。给予了积极的结果所需的FSL的抗原水平取决于被检测抗体的质量和水平。对于碳水化合物抗原，为100微克/毫升的FSL的解决方案通常会导致在强阳性反应。 （三）人类O型红细胞进行了修改，有蚂蚁的特定水平IGEN（标准A kodecytes），并以此来准确和可重复的定量分析人血清中抗A。在这个例子中，反的一个在O型血清测试的滴度是1:32 kodecytes准备从捐赠者的红血球。 （四）血型A和B抗原同时插入到一个单一的O型红细胞样本被用来创建一个弱弱 kodecytes乙。这些kodecytes可以用于ABO血型质量控制的目的。这个结果显示了一个专门制订一个弱乙弱抗A和抗B试剂测试，并给出了预期弱反应kodecyte的分析。