マウス胎児の血管系を標識する方法
Summary
この記事では、胚性皮膚や胸腺、血管を標識する方法を説明します。
Abstract
機能的な血管のネットワークの設立は、器官形成の本質的な部分であり、そして最適な臓器の機能に必要です。例えば、胸腺適切な血管の形成とパターニングに臓器と周辺への成熟T細胞の出口への胸腺細胞のエントリには不可欠です。胸腺の血管の空間的な配置は、局所微小環境からの信号、すなわち胸腺上皮細胞（TEC）に依存します。いくつかの最近の報告では、胸腺血管の欠陥の1,2にこれらの信号の結果のその中断を示唆している。これまでの研究では、新生児と成人の胸腺の血管系の1,2にラベルを付けるために使用されるテクニックを説明してきました。ここでは、胎児胸腺内の血管を標識するためのテクニックを示しています。このメソッドは、FITC -デキストランまたはGriffonia（Bandeiraea）SimplicifoliaレクチンI（GSL 1 -イソレクチンB 4）の使用を組み合わせて顔の静脈注射とCD31抗体染色胸腺血管構造と胸腺の血管周囲の間充織3-5をラベル付けするためにPDGFR -βを識別する。凍結切片またはビブラトームセクションを使用するオプションも用意されています。このプロトコルは、胸腺血管形成にTEC -由来分子の役割を定義するために重要な胸腺血管の欠陥を、識別するために使用することができます。メソッドが全体の血管をラベルとして、それはまた、皮膚や心臓60から10を含む胚全体の複数の臓器や組織に血管のネットワークを分析するために使用することができます。
Protocol
Discussion
セクションの全体のマウントおよびPECAM – 1（CD31）染色は、マウス胎児の血管系を標識するための従来の方法です。これらのメソッドは、直接および/または間接免疫蛍光法、およびマウスの組織を透過性に洗剤を使用する必要があります。これはかなりタイムリーなプロセスであることが分かる。ここで、我々はそれによって抗体のラベリング手順の必要性を取り除きました、B 4顔面…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIAIDからNRMとJLBにSREBの博士論文フェローシップ賞への助成金番号R01AI055001とR01AI082127によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| FITC-dextran | Sigma | FD150S-1G |
| Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 |
| PFA | Fluka | 76240 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR | 25608-930 |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 |
| rat anti-mouse CD31, | BD Pharmingen | 558736 |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 |
| Benzyl Alcohol | Acros Scientific | 148390010 |
| Benzyl Benzoate | Acros Scientific | 105860010 |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Scientific | 152222 |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F |
| Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| 4mL clear vials | National Scientific | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
