Un metodo per l'etichettatura vasi embrionali nei topi
Summary
Questo articolo descrive un metodo per l'etichettatura di pelle embrionale e vasi sanguigni timo.
Abstract
La creazione di una rete funzionale vaso sanguigno è una parte essenziale di organogenesi, ed è necessario per il funzionamento ottimale degli organi. Per esempio, nella formazione timo corretta vascolarizzazione ed il modello è indispensabile per l'ingresso timocita nell'organo e maturo delle cellule T uscita alla periferia. La disposizione spaziale dei vasi sanguigni nel timo dipende segnali provenienti dal microambiente locale, cioè le cellule epiteliali timiche (TEC). Diversi rapporti recenti suggeriscono che la perturbazione di questi risultati segnali in timo vaso sanguigno 1,2 difetti. Studi precedenti hanno descritto le tecniche utilizzate per etichettare il neonatale e adulto vascolarizzazione del timo 1,2. Si dimostra qui una tecnica per l'etichettatura dei vasi sanguigni nel timo embrionale. Questo metodo combina l'uso di FITC-destrano o Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I (GSL 1 – isolectin B 4) iniezioni vena facciale e CD31 colorazione anticorpi per identificare timo strutture vascolari e PDGFR-β per etichettare timo mesenchima perivascolare 3-5. La possibilità di utilizzare criosezioni o sezioni vibratome inoltre è fornita. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare timo difetti vascolari, che è fondamentale per definire i ruoli di TEC-molecole derivate timo nella formazione dei vasi sanguigni. Come metodo di etichette intero sistema vascolare, può anche essere usato per analizzare le reti vascolari in molti organi e tessuti in tutto l'embrione tra pelle e cuore 6-10.
Protocol
Discussion
Whole-mount e PECAM-1 (CD31) colorazione sulle sezioni sono i metodi convenzionali per l'etichettatura del sistema vascolare nei topi embrionale. Questi metodi richiedono l'uso di immunofluorescenza diretta e / o indiretta, e detergenti per permeabilize tessuto del mouse. Questo risulta essere un processo piuttosto tempestivo. Qui, abbiamo impiegato FITC-destrano o isolectin B 4 iniezioni vena facciale per etichettare direttamente la vascolarizzazione embrionali, eliminando così la necessità di fasi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dai numeri concedere R01AI055001 e R01AI082127 dal NIAID di NRM e Premio tesi SREB Fellowship di JLB.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| FITC-dextran | Sigma | FD150S-1G |
| Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 |
| PFA | Fluka | 76240 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR | 25608-930 |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 |
| rat anti-mouse CD31, | BD Pharmingen | 558736 |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 |
| Benzyl Alcohol | Acros Scientific | 148390010 |
| Benzyl Benzoate | Acros Scientific | 105860010 |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Scientific | 152222 |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F |
| Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| 4mL clear vials | National Scientific | B7800-2 |
References
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