一个基于PCR的基因分型方法来区分野生型和观赏品种白茅</em

1。标本采集和保存这种方法是使用新鲜的，冷冻，最近干叶组织开发和测试。 确定茅草和/或JBG草种鉴定专业的分类学家的帮助下组织。其鲜艳的红叶，观赏JBG很容易直观地从野生型的茅草和JBG区分恢复;然而，茅草和JBG恢复从一个几乎没有区别。茅草和恢复的JBG型有绿色，叶片较长，相当大的和较长的根茎，叶面积超过12 JBG（ 图1）。 鲜叶组织提供最丰富的和最高质量的DNA，可以从田间或温室种植一收集白茅植物。如果是用于新鲜组织，收集3小时内提取DNA，以帮助防止退化。否则，准备仓库，keepi及组织吴组织的凉爽和阳光直射。 存放在日后组织DNA提取，最理想的方法是冻结并保存在-80组织°C间立即。不要让冷冻组织解冻之前提取DNA。转移到DNA提取研磨步骤，以防止解冻之前液氮冷冻组织。 如果在-80°C冰箱无法使用，立即干组织。对于干式贮存，一纸信封放到组织和脱水的硅胶或其他活性干燥剂在室温中存放的信封。混有少量指标二氧化硅与非指示硅胶确保二氧化硅是完全脱水，适合干燥植物组织。 使用至少10倍以上的重量鲜叶组织硅胶。植物组织要干24小时内， 随着时间的推移，通过干式贮存的DNA的质量和数量的减少（植物标本馆标本的情况下S）。 2。 DNA的提取从植物组织中提取DNA，按照的DNeasy植物Mini试剂盒（QIAGEN，瓦伦西亚，加州;猫＃69104或69106）制造商的指示，有一个轻微的修改。使用每列建议小于100毫克新鲜组织或低于20毫克干组织，而不是磨大于100毫克，然后转移到新鲜或冷冻组织100毫克（或> 20毫克干组织）适当的管提取。同时核和叶绿体DNA提取。 启动这些程序之前，验证，乙醇添加到AP3的缓冲区/ E和AW。 磨细粉，用在冷藏杵臼研磨三轮液氮>新 ​​鲜或冷冻的叶组织（或干叶组织20毫克）100毫克。 中断的起始原料不足或不足裂解也可以导致DNA的产量较低。仔细研磨的TISSUE和不超载太多组织列。 转让从新鲜或冷冻组织（或粉干组织20毫克），冻粉100毫克至1.5 ml离心管，400μLAP1的缓冲和4μl的RNase A.的每一管可以放置在一个小机架上平衡来监测每管组织的正确重量 。 涡或震动样品（S）混合并孵育10分钟，在65°C时，反相孵化期间的2-3倍管（S）。 每个样品中加入130μL缓冲AP2的。混合反相管（S）数次，并在冰上孵育5分钟。 吸取各裂解成一个单独的QIAshredder小型离心柱，并将其放置在一个2 ml收集管（试剂盒提供）的每一列。离心柱（S）为20,000 XG（〜14,000 RPM）2分钟，每一个新的管（不与试剂盒提供）流过分数将不破坏任何形成的颗粒转移。 加入1.5体积的AP3的缓冲区/E和混合移液。 转移到DNeasy小型离心柱在2 ml收集管650μL混合物。在6000 XG（8000转）1分钟，并丢弃流过离心柱（S）。重复此步骤，每个样品的剩余混合物。 放入一个新的2 ml收集管（S）的自旋列（S），每一列的顶部添加μl缓冲胡的500。在6000 XG（8000转）1分钟，并丢弃流过离心柱（S）。 加入500μl到另一个缓冲区胡每一列的顶部。 20,000 XG（〜14,000 RPM）离心2分钟。这一步将干之列，从而消除任何缓冲区，可以抑制PCR技术中的残留的乙醇。 每个离心柱转移到一个新的1.5 ml离心样品管。加入100μL缓冲AE洗脱每一列的顶部，孵化列（S）在室温下5分钟。离心柱（S）在6000 XG（8000转）收集的DNA为1分钟。 重复这些洗脱步骤一次，到相同的1.5 ml离心管产量200μL样品洗脱的DNA。存储在-20℃直至使用的DNA样本，DNA的浓度取决于组织的类型和储存条件。获得最佳产量时洗脱了200μl缓冲AE的总DNA，但浓度可以增加洗脱体积减少到低至50μL。 3。 DNA的质量和数量的核查测试之前PCR设置使用分光光度计或荧光和凝胶电泳提取DNA的质量和数量。这将有助于确保成功的后续步骤。 使用分光光度计，检测DNA的质量和数量。良好的DNA产量应该在50和150之间，260/280和230/280比值接近2.0纳克/微升。作为一个例子， 图2显示了良好的质量结果，使用的NanoDrop分光光度计（ThermoScientific威尔明顿，DE）。 使用标准的1％琼脂糖凝胶进行电泳。确认没有RNA污染小的裸奔（ 图3）存在比较大的波段（10 KB）。 如果DNA浓度高，稀的DNA样本，以70毫微克/微升后续步骤。 4。 PCR引物在本协议所使用的PCR引物的基础上茅草和JBG基因型之间的叶绿体trnL – F间隔区序列差异。这些差异在形式的SNPs（单核苷酸多态性）而INDELs（插入和删除），允许发展的各种特异引物，通过独特的序列（ 图4）的网站定位的引物。 引物的质量，可以对PCR结果产生重大影响。为了引物从一个有信誉的公司。我们斜生物，公司订购的引物（:/ / www.obliquebio.com/web/“的目标=”_blank“> http://www.obliquebio.com/web/，汉茨维尔，AL），要求脱盐过程的唯一标准。 trnL – F阳性对照引物：的底漆集放大的叶绿体trnL – F间隔区最基层类群11-13作为一个很好的阳性对照（产生一个890 bp的条带）。 名称 序列 trnF基因（GAA） – F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3' trnL（5'外显子） – C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3' 野生型的茅草引物：这个引物是特定的茅草，不健全JBG基因型trnL-F区。一套带为595 bp的结果。 名称 序号uence trnLF-C F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3' trnLF-C – R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3' JBG和JBG恢复引子：这个引物是特定JBG基因型和不健全茅草trnL-F区。一套带为594 bp的结果。 名称 序列 trnLF R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3' trnLF-R – R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3' 悬浮在无核酸DDH 2 O的足够量的每个引物获得100毫米的股票，可以储存在-20°C，长期的解决方案。 每个引物的股票稀释到12毫米，前PCR设置步骤。 5。 PCR设置 DNA提取使用上述引物PCR反应扩增。包括阳性对照，以确保所有的PCR试剂运作良好，并可以生成一个乐队。包括阴性对照，以确保没有任何试剂与无用的DNA污染。 阴性对照不包含模板，并应导致没有带生产。 准备薄壁PCR管中的所有反应，以便更好地之间的热循环块和样品的传热。 我们建议使用市售气雾剂无枪头，以帮助避免污染。 对于每一个孤立的DNA样本，建立了50μLPCR反应，用0.2毫升薄壁PCR管冰在下面列出的顺序加入下列试剂的每一个以上的引物。如果多个样品正在准备，使该异常包含所有试剂鸡尾酒DNA为模板，建立统一的条件之间的所有反应。 PCR试 ​​剂 卷使用 最后Concetration 无核酸DDH 2 O的 40.5微升的10X优势2 PCR缓冲液（Clonetech，CA） 5.0μL 10％（V / V） 优势超纯PCR dNTP混合液（10毫米，Clonetech，CA） 1.0μL 0.2毫米引物1（DDH 2 O的 12μm的） 1.0μL 0.24μM的 2底漆（12μm的在DDH 2 O的 ） 1.0μL 0.24μM的优势2聚合酶混合物（Clonetech，CA） 0.5μL 1％（V / V） DNA提取（70毫微克/反应;需要调整DDH 2 O容量） 1.0μL 1.4纳克/微升总计：50.0微升为了确保所有的PCR试 ​​剂运作良好，设置阳性对照，阳性对照引物。 此引物为白茅，JBG同样适用，JBG恢复和其他草，将导致带为890 bp的。 设置阴性对照，使用相同的控制底漆作为阳性对照，使用DDH 2 O的 ，而不是DNA的提取。 如果所有试剂的DNA污染，这种反应会导致在没有带。 如果DNA浓度低，更多的DNA可以被添加到每个反应，调整无核酸DDH 2 O的使用量，以使反应总体积50μL。 不要使用超过5μL的DNA（10％总体积）每ŕ的反应的影响，尽可能的DNA样本中的杂质会抑制PCR反应。 6。 PCR循环开展了激烈的盖子使用以下的PCR循环参数配备热循环的PCR扩增。我们使用的Mastercycle亲小号热循环仪（Eppendorf公司，Hauppauge的，纽约州）的设置与标准温度斜坡条件。应执行任何质量热循环。 周期 变性退火 聚合 1 2分钟在95℃ 2 在95°C 30秒 30秒，61°C 90秒68°C间，35个循环 3 5分钟在68°C间保持在4°C，直到样品被删除</TD> 优化PCR（包括引物退火温度，延伸时间和循环次数）的条件下，需要的DNA的质量取决于引物，Taq酶或热循环型使用。 我们建议使用渐变功能的热循环时，确定最佳退火温度。 如果正在使用的热循环，没有了激烈的盖子，加1滴矿物油，每个样品的顶部，以防止在PCR循环蒸发。 7。 PCR产物的凝胶电泳可视化的分析结果，单独的1％琼脂糖凝胶使用标准电泳PCR产品。 结合5μL每个PCR扩增产品标准的DNA上样缓冲液2μL（通常是5倍或6倍的解决方案）。 加载到1％琼脂糖含ETBR（DNA染色溴化乙锭）凝胶与电子样本ither TAE或SB（四硼酸钠）缓冲系统16。我们使用10毫克/毫升ETBR每100毫升1％琼脂糖（0.1微克/毫升）原液1μL。 运行样品〜120V，直到染料前端达到¾凝胶的总长度。 在紫外光下（例如短波紫外线灯箱），检查结果乐队，看看是否合适的片段扩增。 使用可用的照片，文件系统或相机记录凝胶和由此产生的带。 8。代表结果可视化的PCR产物后，茅草有JBG或恢复JBG（ 图5）相比，独特的带型。对于每一个DNA样本的trnL – F阳性对照引物应导致在一个单一的高强度〜890 bp的带。这验证所有的PCR试剂运作良好。同样，阴性对照组（无模板）反应应包含不带任何底漆小号等使用。这验证试剂没有受到污染。 如果DNA样本来自野生型的茅草，PCR反应中使用的茅草特异引物集将在约595 bp的单波段的结果，而JBG特异引物将导致在没有带。同样，如果DNA样本是来自的JBG或者恢复JBG，PCR反应中使用JBG特异引物集将导致在〜594 bp的单波段，而茅草特异引物，将导致在没有带。因为JBG和恢复JBG具有相同的核酸序列，因此，他们将有相同的带型。如果有许多样品的凝胶相比，在相同的时间，我们建议运行设置每个引到另一个派生的所有样品，从而使其更容易扫描阳性结果的样品。 JBG和JBG恢复之间的形态差异是相当明显的（如红色的叶子和小身材的JB的Ğ与绿色的色彩，较大的身材和积极成长的JBG恢复），而PCR结果将是相同的，JBG品种很容易区分植物形态。 图1比较，温室种植白茅变种。koenigii（日本血草），恢复了一白茅VAR。koenigii（JBG恢复）和一白茅 （茅草野生型）。 图2。使用的NanoDrop分光光度计验证DNA样本的例子。请注意，不论使用的分光光度计，260/280的比例应该接近1.8 260/230的比例应该接近2.0。 内容】“> 图3。DNA样本验证使用标准1％琼脂糖凝胶电泳。大小分析用于商业DNA标记。巷＃4是一个质量较差的DNA样本的例子，显示出涂抹一些RNA污染。 白茅变种。koenigii（日本血草），trnL – F区序列图4。恢复一白茅VAR。koenigii（JBG恢复）和一白茅 （茅草野生型）。垂直的黑色箭头表示从单​​核苷酸多态性和个InDel产生的序列的差异。水平的绿色箭头表示野生型的茅草用于茅草-特异PCR引物的位置。水平的红色箭头表示宝JBG和JBG sitions恢复JBG-特异性PCR引物。 图5。代表的JBG与JBG恢复茅草和JBG特异引物的trnL – F阳性对照和无模板的阴性对照以及结合的DNA样本，从茅草所得的PCR产物凝胶电泳结果。