Biz kloroplast trnL-F boşluk bölge içinde hedef DNA dizisi farklılıklar çeşitler arasındaki farklılaştırmak için çeşitli spesifik PCR primerleri kullanan bir maliyet-etkin ve hızlı moleküler genotipleme protokol sağlar<em> Imperata cylindrica</em> (Cogongrass) sadece morfoloji ile ayırt edilemez. Bu çeşit federal listelenen zararlı ot, cogongrass ve yakından ilgili, yaygın süs çeşitli, ben dahil<em>. cylindrica</em> Var.<em> Koenigii</em> (Japonca kan otu).
Yabani tip I cylindrica (cogongrass) olumsuz Afrika, Asya, Avrupa, Yeni Zelanda, Okyanusya ve Amerika 1-2 genelinde 73 farklı ülkede tarım ve doğal kaynakları etkileyen, dünyanın en kötü on invaziv bitkilerden biridir. Cogongrass yerli bitki türlerinin büyük bir çeşitlilik yerinden ve sırayla yem ve barınma için yerinden yerli bitki türleri bağlıdır yerli hayvanlarını tehdit hızla yayılan, monodominant standları oluşturur. Sorunun eklemek için, bir süs çeşitli [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] yaygın Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron ve Japon kan otu (JBG) adları altında pazarlanıyor. Bu çeşit varsay steril ve non-invaziv ve onun kırmızı renkli yaprakları için arzu edilen bir süs olarak kabul edilir. Ancak, doğru koşullar altında, JBG canlı tohum üretebilir (Carol Holko 2009, kişisel iletişim) ve i yeşil bir dönebilirsinizBu vahşi tip invaziv çeşitli 4 (Şekil 1) ayırt edici özellikleri üzerine alır gibi cogongrass çoğu zaman ayırt edilemez nvasive formu. Bu tanımlama bile iyi eğitimli bitki taksonomistlerin için morfolojisi zor bir görev kullanarak yapar. Saldırgan bir yeşil fenotipi JBG ile geri dönmesinin de nadir bir olay değildir. Kodlama ve nükleer ve kloroplast hem DNA değişken bölgelerin dizi karşılaştırmalar kullanarak, JBG Maryland, South Carolina, ve Missouri eyaletlerinde içinde yeşil invaziv gecmistir doğruladı. Aktif bir cogongrass istilası var olmadığı JBG kıta ABD'nin hemen her eyaletinde satılan ve dikilmiş oldu. Iyi anlaşılmış değil geri sorunun ölçüde rücu bitkiler belgelenmemiş ve genellikle yok çünkü.
Bu molekül protokolünün Uygulama JBG döner tanımlamak için bir yöntem sağlar ve co-meydana gelen, bu çeşitler kalmasına yardımcı birnd muhtemelen melezleştirerek. Cogongrass farklı bir genotip ile geçerken, bir zorunlu outcrosser ve,-rüzgar dağınık canlı üretmek 5-7 geniş mesafelerde cogongrass yayıldı tohumları olabilir. JBG cogongrass göre biraz farklı bir genotip vardır ve cogongrass olan canlı melezler oluşturur mümkün olabilir. Sorunun eklemek için JBG cogongrass 8-10 daha soğuk ve hoşgörülü bir gölge olduğunu ve bu iki çeşit arasındaki gen akışı daha agresif olan melezler oluşturmak için muhtemelen, vahşi tip cogongrass daha cesur, hoşgörülü, soğuk ve gölge. Yabani tip cogongrass anda Güneydoğu ABD'nin dünya çapında 490 milyon hektarın üzerinde, infests iken 500.000 hektarı aşan infests ve hızla kuzeye geniş niş ve coğrafi potansiyeli 3,7,11 nedeniyle yayılır olarak ABD büyük kısmını işgal yeteneğine sahiptir. Genetik bir geçiş potansiyel USDA-APHIS Federal Zehirli Hafta Programı için ciddi bir endişe kaynağıdır. Şu anda, USDA-APHIS devletler wh JBG yasaklarere büyük cogongrass enfestasyonlar (örneğin, Florida, Alabama, Mississippi) vardır. Cogongrass ve JBG dağılımları genişletmek Ancak, bir araya gelen iki çeşit önlenmesi daha zor kanıtlayabilirim. Ayrıca, döner JBG dağılımı henüz bilinmeyen ve morfoloji aracılığıyla bu çeşitler tanımlamak için yeteneği olmayan bazı cogongrass istilalarını JBG döner bir sonucu olabilir. Ne yazık ki, mevcut kimliklenme moleküler yöntemler genellikle alıcı ve masraflı zaman her ikisi de AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) ve DNA dizi analizi, güveniyor. Burada, doğru cogongrass ve JBG dönmek ayırt ilk maliyet-etkin ve güvenilir PCR tabanlı moleküler genotiplendirme yöntemi sunuyoruz.
ABD fidanlık ve peyzaj sanayi egzotik ve yeni bitki türlerinin yetiştirilmesi ve satan gelişirler. Ticaretin giderek artan küreselleşme ile birleştiğinde Bu, bir istilacı bitki türleri, girmek kurmak ve ABD'de federal invaziv olma potansiyeline de dahil olmak üzere, genellikle mevcut değildir bilgiye dayanır bu tür bitkilerin düzenleme yeteneği yayacağı şansını artırır , yerli ve vatandaşlığa taksonlar doğru taksonomisi ve genetik çeşitlilik. Invaziv bitkilerin bilgimiz genelde sınırlı olduğundan, gizli invaziv özellikleri ile ithal bitkiler isteyerek sadece onlar bizim tarım ve doğal kaynaklar işgal daha sonra öğrenmek için getirilmiştir. Bu protokol, I. ile ilişkili bu sorunlara yönelik amaçlar doğru wild-tip cogongrass ve süs JBG muadili rücu formu ayırt edebilirsiniz ilk basitleştirilmiş moleküler yöntem sağlayarak cylindrica çeşitleri.
Bu protokolün geliştirilmesi için jove_content ">, wild-tip cogongrass 2008 yılının Haziran ayında Jay, FL yakınlarındaki Santa Rosa County Pond Creek Orman Biriminde vatandaşlığa nüfus toplanmıştır. JBG ticari bir kreş (Bluebird Kreş, Inc temin edildi .. Riverdale, MA University Park ve Haziran 2009 yılında;;) 2008 yılı Haziran ayında yanı sıra Columbia ev sahibi koleksiyonundan, MO JBG Haziran 2008'de Clemson University, SC de Campbell Jeoloji Müzesi avlusunda elde edilen döner ve Columbia, 2009 yılında MO (Leland Cseke tarafından tanımlanan) bir ev sahibi ön avludan. Tüm bitkiler Huntsville, Alabama Üniversitesi (Huntsville, AL) bulunan bir serada tutuldu.Bu bitkilerden toplanan DNA Genetik sekans genellikle barkod tesisleri 2 için kullanılan 9 bağımsız DNA bölgeleri derinliği karşılaştırmalarda dahil. Tüm durumlarda, JBG ile dizilimler, böylece yardımcı JBG geri olanlar için bir% 100 idi eşleşmeJBG gerçekten yeşil, invaziv forma dönmek doğrulayın. Sadece nükleer ITS ve kloroplast trnL-F bölgelerde genetik cogongrass ve JBG ayırt etmek için kullanılabilir farklar var. TrnL-F bölgede 2 SNP ve 2 indellerin (eklemeler ve silmeler) sahipken ITS bölgesi, cogongrass ve JBG arasında 3 SNP (tek nükleotid polimorfizmleri) bir toplam vardır. Bu genetik farklılıkların doğal tip cogongrass ve JBG döner ayırt edebilirsiniz ki geliştirilecek çeşitli spesifik PCR primerleri izin verdi. En güvenilir sonuçları plastid trnL-F bölgede elde edilen primerler gelmiş. Dolayısıyla, bu protokol cogongrass, JBG ve kloroplast genomunun trnL-F bölge ve JBG (Şekil 4) döndürüldü arasındaki farklar dizisi dayanmaktadır.
Söz konusu çeşitlerin daha spesifik primerler oluşturmak yardımcı olmak ve yakından ilgili türler, al yanlış pozitif önlemek içinI. l bilinen trnL-F sekansları cylindrica çeşitleri ile ilgili çimen türleri (29 türünden 43 bağımsız dizileri, örneğin, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-iş buldum, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorgum halepense) den trnL-F dizileri ile karşılaştırıldı. Biz çim, çeşitli özel primerlerin özgüllük 29 tür arasında çeşitli spesifik primer dizilerinden araştırılmasına karşın kapsamlı diğer birçok ot türleri DNA çoğaltılması için, yeteneği gidilmemiş. Sonuç olarak, DNA çıkarılması için kullanılan doku dikkatle I. olarak tespit edilmelidir cylindrica önce bu protokol başlangıç için. Çim, sonra cogongrass veya JBG ya olarak tespit edilemiyorsa, biz dizileri cogongrass veya JBG için tam bir eşleşme olduğundan emin olmak için PCR ürünü sıralama öneririz. Şu anda, belirli bir otu numunenin bir kimlik doğrulama en doğru yöntem t her iki PCR gerçekleştirmek için olanRNL-F ve ITS bölgeler, dizisi PCR ürünlerinin doğrulanması ve kesin takson bilinen dizileri dizilerinin karşılaştırılması izledi. DNA kontrolü Bu protokol ayrıntılı primerler (trnL-F bölge için) ya da diğer primerler diğer yayın 13-15 bu kullanılabilir kullanılarak büyütüldü edilebilir. Sıralama çok daha fazla emek ve basitleştirilmiş usuller kullanılarak daha yoğun bir maliyettir.
PCR için kullanılan primerler kalitesi prosedürün başarısı için kritiktir. Biz Eğik Bio, Inc (edinilebilir Bu prosedür için primerler yaptık http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Eğik Bio gelen primerler sipariş için avantajı bizim laboratuarda optimizasyonu için kullanılan primerler olarak özdeş numune üretimi serisi her astar hacimde çok sayıda depolamak olmasıdır. Sonuç olarak, astar, sadece aynı sıra var, ama t değilhey bu protokolde kullanılan aynı üretim yeri gelir. Aynı partiden primerler kullanılarak, PCR primerleri kalitesinde farklılıklar sonucu olabilir prosedürü gereksiz değişkenler önlemek yardımcı olabilir. Aynı şekilde, diğer Taq polimeraz PCR, kullanılan Taq polimeraz kalitesi için sorunsuz çalışır ise PCR sonuçlarının kalitesi üzerinde bir etkisi olacak. PCR daha iyi tutarlılık sağlamak için, Clontech'in reaktifleri kullanarak protokolü optimize etmiş. Avantaj 2 Polimeraz (Clontech, Mountain View, CA, Kedi # 639.201 veya 639.202) sağlam, sıcak başlangıç Taq polimeraz karışımı ve yüksek özgüllük ve daha doğru amplifikasyonlar sağlamak için yardımcı olan bir redaksiyon enzimdir.
Bu protokol anneden Otların içinde miras kloroplast DNA dayanır Çünkü cogongrass ve JBG genotipleri arasında hibridizasyon olaylar bizim moleküler tanımlama prosedürü ile çekilmiş olabilir. Hypridization suspe olduğu durumlardacted, biz her iki ebeveyn devralınan nükleer bölgeler kullanmanızı öneririz. Bitki genotipleme dikkate almak en sık kullanılan non-plastid değişken bölgenin nükleer ribozomal ITS bölgesi 13-15,17 olduğunu. Şu anda, aynı PCR tüpünde nükleer ITS bölgenin bununla kloroplast trnL-F bölgenin amplifikasyonu multiplekslemesi doğru ilerleme kaydedilmektedir. Nükleer DNA bölgeleri ile plastid multiplekslemesi potansiyel olarak tek başına ya kullanma sınırlamaları aşmak olur, ancak bu yöntemlerin ayrı ayrı bir dava üzerinde fizibilite belirlemek için optimizasyon ve ek değerlendirme gerektirir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve bu tür moleküler işaretleri (floresan astar probları), gibi yeni teknolojilerin kullanımı da fail-safe ve doğru bitki genotipleme yöntemler olarak değerlendirilmektedir.
Burada sunulan protokol JBG vahşi tip cogongrass bu gelen geri ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yaklaşım sağlar. Biz kullanmak teşvikBu protokolün rs Bu protokolün kullanılmasından elde edilen sonuçları rapor etmek bize. Bu paylaşılan bilgi JBG döner dağıtımı hakkında bilgi vermek yardımcı olacaktır. Bu aynı zamanda USDA de düzenleyiciler oldukça invaziv cogongrass çeşitlerinin yayılmasını ve potansiyel hibridizasyon aşmak gerekiyor olabilir eylemler hakkında bilinçli kararlar almanıza yardımcı olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Biz örnek edinme konusunda yardım için Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), ve Betty Marose (UMD) teşekkür . Biz video filme yaptığı çalışmaların öğrencileri Andrew Adrian (UA-Huntsville) ve Derek Thacker (UA-Huntsville) bu protokol test kendi yardım için, ve Joseph Herdy teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Balık ve Yaban Hayatı Vakfı tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |