の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ</em

1。標本の収集と保存この方法は開発され、新鮮な、凍結、最近乾燥した葉組織を用いて試験した。 cogongrassおよび/または草種の同定に特化し分類学者の助けを借りて、組織をJBGを識別します。その鮮やかな赤い葉で、観賞用JBGは、視覚的に戻す野生型cogongrassとJBGと区別するのは簡単ですが、cogongrassとJBG戻すには、互いにほとんど区別できません。 CogongrassとJBG戻っ表現型は緑色、長い葉が、かなり大きいと長い地下茎と、JBG 12（ 図1）より葉面積を持っています。 新鮮な葉組織は、最も豊富な最高品質のDNAを提供し、フィールドまたは温室栽培I.から収集することができますチガヤの植物。新鮮な組織を使用する場合は、劣化を防ぐために、コレクションの3時間以内にDNAを抽出します。それ以外の場合は、ストレージ、keepiのための組織を準備直射日光のngの組織涼しいとアウト。 後日、DNA抽出のための組織を保存するには、最適な方法は、°C、直ちに-80℃で組織を凍結して保存することです。凍結組織は、DNA抽出の前に解凍することはできません。解凍防ぐために、DNA抽出の粉砕工程に先立って、液体窒素中に凍結組織を転送します。 -80℃の冷凍庫が利用できない場合は、乾いたティッシュはすぐに。乾式貯蔵のために、紙封筒に組織を配置し、室温で乾燥シリカゲルまたは他のアクティブな乾燥剤でエンベロープを保存します。 シリカは、シリカが完全に脱水し、適しているようになり、非示すと混在インジケーターシリカ少量の植物組織を乾燥させる。 重量新鮮葉組織より少なくとも10倍以上のシリカゲルを使用しています。植物組織は、24時間以内に乾燥する必要があります。DNAの質と量が（押し葉標本の場合のように時間をかけて乾燥貯蔵によっても削減されます。秒）。 2。 DNA抽出 1マイナー変更を加えた、製造元の指示に従って、植物組織からDNAを抽出するために、DNeasy植物ミニキット（カタログ番号69104または69106キアゲン、バレンシア、CA）に従ってください。代わりに、列ごとに提案され、100未満mgの新鮮組織または20未満mgの乾燥組織を使用するのではなく、適切なチューブに（乾燥した組織から、あるいは> 20 mg）を新鮮あるいは凍結組織から100 mgを転送し、100ミリグラム以上のを挽くと、抽出のために。核およびプラスチドDNAが同時に抽出されます。 これらの手順を開始する前に、そのエタノールをバッファAP3 / EとAWに追加されたことを確認します。 冷やした乳鉢と乳棒で粉砕して液体窒素3回を使用して微粉末に新鮮あるいは凍結した葉組織（または乾燥した葉組織の> 20 mg）の> 100 mgを挽く。 出発物質の不足の中断や不十分な溶解こともできますDNAの収率が低下につながる。慎重にTISSを挽くUEは、あまりにも多くの組織でカラムをオーバーロードしていません。 新鮮あるいは凍結組織（または乾燥した組織からの粉末20mgの）からバッファAP1の400μlを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに100 mgの凍結粉末を転送するとRNase Aの4μlの各チューブに小さなラックに配置することができますチューブ当たり、組織の正確な重量を監視するためにバランスをとります 。 65℃混ぜ、10分間インキュベートするボルテックスまたは手試料（S）°C、2〜3回インキュベーションの間に反転管（S）。 各サンプルにBuffer AP2の130μlを添加します。反転管（S）数回混和し、氷上で5分間インキュベートする。 ピペットでそれぞれ独立したQIAshredderミニスピンカラムにライセートを、2 mlのコレクションチューブ（キットに付属）で各列に配置します。遠心2万XG（〜14,000 rpm）で2分間カラム（s）、および任意の形成されたペレットを中断せずに、各フロースルーを新しいチューブに分（キットには付属しません）に転送します。 /バッファAP3の1.5倍量を追加します。E、およびピペッティングにより混合する。 2 mlのコレクションチューブにDNeasyミニスピンカラムに混合物の650μlを転送します。遠心分離は6,000 xgで（〜8,000 rpm）で1分間カラム（s）、およびフロースルーを捨てる。各サンプルの残りの混合物で、この手順を繰り返します。 新しい2 mlコレクションチューブ（S）にスピンカラム（複数可）を配置し、各列の先頭にバッファAW 500μlを加える。遠心分離は6,000 xgで（〜8,000 rpm）で1分間カラム（s）、およびフロースルーを捨てる。 各列の先頭にバッファAWの別の500μlを添加します。 2万XG（〜14,000 rpm）で2分間遠心します。このステップは、このようにPCRを阻害することができるバッファに含まれる残留エタノールを除去し、カラムを乾燥させます。 新しい1.5 mlのマイクロ試料管に各スピンカラムを移します。溶出のために各列の上部に100μlのBuffer AEを追加し、室温で5分間カラム（複数可）をインキュベートします。 DNAを収集するために6000 XG（〜8,000 rpm）で1分間遠心分離カラム（複数可）。 これらの溶出は、サンプル200μlを得るために、同じ1.5 mlのマイクロ遠心チューブにDNAを溶出し、1回の手順を繰り返します。使用するまで-20℃でDNAサンプルを格納します。DNA濃度は、組織の種類と保管条件によって異なります。バッファAE200μlの合計でDNAを溶出する際に最適な収量が得られますが、濃度は、溶出ボリュームはわずか50μlに減少している場合は増加することができます。 3。 DNAの質と量の検証分光光度計または蛍光光度計とゲル電気泳動を用いてPCRをセットアップする前に抽出したDNAの質と量をテストします。これは、後続のステップの成功を確実にするのに役立ちます。 分光光度計、テストDNAの質と量を使用します。優れたDNAの収量は50〜150の間でなければなりません2.0に近い280分の260と280分の230比ng /μLの。例として、 図2は、光度計分光光度計（ThermoScientificを使用して、質の良い結果を示しています。デラウェア州ウィルミントン）。 標準1％アガロースゲルを用いて電気泳動を実施しています。 RNAのコンタミネーションから少し縞（ 図3）を持たない比較的大きなバンド（> 10 KB）の存在を確認してください。 DNA濃度が高い場合は、以降の手順は70 ng /μlににDNAサンプルを希釈する。 4。 PCRプライマーこのプロトコルで使用されているPCRプライマーはcogongrassのプラスチドtrnL-Fのスペーサー領域とJBG遺伝子間の配列の違いに基づいています。これらの違いは、一意のシーケンス（ 図4）のサイトでプライマーを配置することによって、様々な特異的プライマーの開発を許可されているSNPの形（一塩基多型）に来るとindelsの（挿入と削除）。 プライマーの品質はPCRの結果に大きな影響を持つことができます。評判の良い会社からの注文プライマー。我々は斜バイオ株式会社（から我々のプライマーを注文する唯一の標準的な脱塩手順を要求する:/ / www.obliquebio.com/web/ "ターゲット=" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/、ハンツヴィル、アラバマ州）。 trnL-F陽性対照プライマー：このプライマーセットは、ほとんどの草の分類11月13日のプラスチドtrnL-Fのスペーサー領域を増幅し、良好なポジティブコントロール（890 bpのバンドになる）として機能します。 名 シーケンス trnF（GAA）-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL（5 'エクソン）-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' 野生型cogongrassプライマー：このプライマーセットはcogongrassに固有であり、JBGの遺伝子型のtrnL-F領域を増幅していません。 595 bpであり、バンド内の結果セット。 名 SEQuence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBGとプライマーを元に戻すJBG：このプライマーセットは、遺伝子型をJBGに固有のものであり、cogongrassのtrnL-F領域を増幅していません。 594 bpであり、バンド内の結果セット。 名 シーケンス trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' -20°C、長期に保存することができます100mMのストック溶液を得るためにヌクレアーゼフリーのddH 2 Oの十分なボリューム内の各プライマーを再懸濁します。 PCRのセットアップ手順の前に12 mMの各プライマーストックを希釈する。 5。 PCRのセットアップ DNA抽出は、PCR反応における上記プライマーセットをそれぞれ用いて増幅されています。すべてのPCR試薬がうまく働いて、バンドを生成することができることを保証するために陽性コントロールが含まれています。試薬のそれないことを確認するための負の制御を含む不要なDNAで汚染されている。 ネガティブコントロールは、テンプレートを含まないとしないバンドの生産になるはずです。 サーモブロックと試料との間の優れた熱伝達を可能にするための薄壁PCRチューブ内のすべての反応を準備します。 我々は、汚染を避けるために、市販のエアロゾルフリーピペットチップを使用することをお勧めします。 各単離されたDNAサンプルについては、下記の順序でICEに以下の試薬を加えることにより0.2 mlの薄壁PCRチューブに上記プライマーセットをそれぞれ用いて50μlのPCR反応を設定します。複数のサンプルが用意されている場合は、例外を除いてすべての試薬を含むカクテルを作るDNAテンプレートのすべての反応の間に均一な条件を確立します。 PCR試薬 使用したボリューム 最後のConcetration ヌクレアーゼフリーのddH 2 O 40.5μL 10Xアドバンテージ2 PCRバッファー（クロンテック、CA） 5.0μL 10％（v / v）の利点純PCRのdNTPミックス（各10mMの、クロンテック、CA） 1.0μL 0.2mMのプライマー1（DDH 2 Oの12μm）の 1.0μL 0.24μM プライマー2（DDH 2 Oの12μm）の 1.0μL 0.24μM アドバンテージ2ポリメラーゼミックス（Clonetech社、カリフォルニア州） 0.5μL 1％（v / v）の DNA抽出（70 / NG反応;必要に応じてのddH 2 Oの音量を調整） 1.0μL 1.4 ng /μlに合計：50.0μL すべてのPCR試薬がうまく機能していることを確認するには、陽性対照プライマーを用いてポジティブコントロールをセットアップします。 このプライマーセットは元に戻すと他の草をJBG、cogongrass、JBGのために同様に動作し、890 bpであるバンドになります。 代わりに、DNAの抽出のddH 2 Oを使用して、ポジティブコントロールとして設定された同じコントロールプライマーを用いて負の制御を設定します。 すべての試薬 ​​は、DNAは汚染の自由である場合、この反応はないバンドになります。 DNA濃度が低い場合は、より多くのDNAは、ヌクレアーゼフリーのddH 2 Oの量は、50μlの総反応容量をもたらすために使用される調整は、各反応物に添加することができます。DNA以上の5μlの（の10％を使用しないでください。 Rあたりの総容積）eactionは、DNAサンプルに含まれている可能性不純物としてPCR反応を阻害することができる。 6。 PCRサイクリング以下のPCRサイクルパラメータを使用して加熱蓋付きサーマルサイクラーを装備でPCR増幅を行っています。我々はMastercycleプロSサーモ（エッペンドルフ、ホーポージ、ニューヨーク州）は、標準温度ランプの条件で動作するように設定してください。どのような品質のサーモも実行する必要があります。 サイクル アニーリング変性 重合 1 95℃で2分°C 2 95°Cで30秒 30秒61℃で90秒68°Cで35サイクル 3 68℃5分°C サンプルが削除されるまで4℃で保持する</TD> DNAの品質に応じて、必要に応じてPCR（プライマーアニーリング温度、伸長時間、サイクル数を含む）のための条件を最適化し、プライマーは、サーモのTaqポリメラーゼまたは型が使用されます。 我々は最適なを決定する際に、グラデーションが可能なサーマルサイクラーを使用することをお勧めしアニーリング温度。 使用されているサーモは、加熱された蓋を持っていない場合は、PCRサイクル中の蒸発を防ぐために、各サンプルの上にミネラルオイルを1滴を追加します。 7。 PCR産物のゲル電気泳動独立したPCR産物は、標準的な電気泳動を用いて1％アガロースゲル上で、分析の結果を可視化する。 各増幅PCR産物の5μlを標準的なDNAローディングバッファー2μlの（通常は5倍または6倍溶液）を兼ね備えています。 電子で作られたEtBrを（DNA染色のための臭化エチジウム）を含む1％アガロースゲルにサンプルをロードするither TAEまたはSB（ホウ酸ナトリウム）緩衝液系16。我々は、100ミリリットル、1％アガロース（0.1μg/ ml）をあたり10 mg / mlのEtBrをストック溶液1μlを使用しています。 染料前面に達するまで〜120Vでサンプルを実行¾ゲルの合計の長さ。 UV光（短波長UV光ボックスなど）の下で、適切な断片が増幅されたかどうかを確認するために生じるバンドを点検します。 利用可能な写真ドキュメントシステムやカメラを用いたゲル、その結果バンドを文書化します。 8。代表的な結果 PCR産物を可視化すると、cogongrassはJBGまたは元に戻しJBG（ 図5）のそれに比べてユニークなバンドパターンを持っています。各DNAサンプルについては、trnL-F陽性コントロールプライマーセットは〜890 bpの単一の高強度のバンドになるはずです。これは、すべてのPCR試薬がうまく機能していることを確認します。同様に、ネガティブコントロール（テンプレートなし）反応は、任意のプライマーのためのバンドを含まないようにすべきらは使用されます。これは、試薬のどれが汚染されなかったことを確認します。 DNAサンプルは、野生型cogongrass、JBG特異的プライマーなしのバンドになりつつcogongrass特異的プライマーセットは〜595 bpの単一のバンドになり用いたPCR反応から派生している場合。 DNAサンプルは、JBGから派生した、またはJBG元に戻された場合cogongrass特異的プライマーなしのバンドになりながら、同様に、JBG特異的プライマーセットを用いたPCR反応は、〜594 bpの単一のバンドになります。 JBGとJBGを戻すと、同一の核酸配列を持っているので、それ故に同一のバンドパターンがあります。多くのサンプルが同時にゲル上で比較されるのであれば、我々は、このように、それが容易に肯定的な結果を得るためにサンプルをスキャンするようになって、お互いに隣接し、それぞれのプライマーから派生したすべてのサンプルを実行することをお勧めします。 戻りをJBGとJBGの間に形態的な違いはかなり明らかである（葉とJBの小さい身長の例：赤色 PCRの結果が同じになりながら、G対緑の着色、大きな身長とJBGの積極的な成長戻す）は、そう、JBG品種は、植物の形態を使用して区別するのは簡単です。 図1温室効果の比較成長チガヤ VAR。 チガヤ （日本人の血草）、差し戻しI.チガヤ VAR。 チガヤ （JBG元に戻す）とI.チガヤ （野生型cogongrass）。 図2光度計分光光度計を用いて検証したDNAサンプルの例を示します。にかかわらず、使用される分光光度計、260/280比に近い1.8〜なければならないおよび260/230比が2.0に近いことに注意してください。 ontent "> 図3 DNAサンプルは、1％アガロースゲル上で標準的なゲル電気泳動を用いて検証した。市販のDNAマーカーのサイズは分析のために使用されていました。レーン＃4はスミアといくつかのRNAのコンタミネーションを示す、質の悪いDNAサンプルの一例です。 図4。 チガヤ VAR。 チガヤ （日本人の血草）のtrnL-F領域の配列アラインメントでは、I.を差し戻しチガヤ VAR。 チガヤ （JBG元に戻す）とI.チガヤ （野生型cogongrass）。黒い縦の矢印は、SNPとindelsのから得られた配列の違いを示しています。水平方向の緑の矢印はcogongrass特異的PCRに使用する野生型cogongrassプライマーの位置を示している。水平方向の赤矢印は、POを示すJBGとJBG-特異的PCRに用いるプライマーを元に戻すJBGの回転位置。 図5。cogongrassから派生したPCR産物のゲル電気泳動の代表的な結果は、JBGとcogongrassとJBG特異的プライマーと同様にtrnL-Fポジティブコントロールとテンプレートなしのネガティブコントロールと組み合わせたDNAサンプルを元に戻すJBG。