使用基因型的方法预测HIV-1辅助用途（归经）的序列分析

该协议被总结在图。 4。 1。采集血样在EDTA管收集至少3毫升的血液在临床的网站。 可将样本存储在一个星期，在4℃下只要可能的实验室通过普通邮件发送EDTA血液样本。 2。艾滋病毒的RNA和/或DNA的分离获取从1000微升的全血，血清或血浆中的病毒RNA和/或DNA，使用在MagNA Pure契约核酸隔离I包我在MagNA Pure紧凑型系统。 洗脱获得的RNA或DNA在50μlTE缓冲液中。或者，其他的核酸纯化程序可以被使用。 3。 env区的扩增扩增的env无论从等离子体RNA或原病毒DNA的区域（图2和图4）。一个长1245 bp的产品，包括大多数的Env蛋白（新台币6556-7811 according至HXB2）被生成。 RNA样品的RT-PCR反应病毒RNA呈现一个非常复杂的二级结构（图4），可能会阻碍反转录（RT）反应。为了避免这个问题，在65℃下孵育10μlRNA提取10分钟（已经在PCR管中，并在PCR机器），然后将温度降低至50℃。 加入40μl的PCR扩增预混试剂，包括引物env-F的和Env-R。 预混RT-PCR在内务系统： 体积/反应（微升） 终浓度 无RNA酶H 2 O 14.4 5×缓冲液（Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒） 10 1个 5倍Q-解决方案 10 1个 dNTP混合物（10毫米） <td> 2 400μM的每种dNTP 体酶混合物混合（Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒） 2 入门ENV-F（100μM） 0.3 0.6μM 入门ENV-R（100μM） 0.3 0.6μM RNase抑制剂（RNA酶抑制剂） 1 5单位/反应 的env-F：的5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3'（核苷酸6556→6586根据HXB2） ENV-R：的5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3“（nt的7785←7811） 运行反转录（RT）反应在50℃下30分钟。 运行第一PCR如下： 95°C，15分钟 1个 95°C，30秒 50℃，30秒 72°C，2分钟</td> 1个 95°C，30秒 56℃，30秒 72°C，2分钟 38× 72°C，10分钟 4°C∞ DNA样品PC​​R反应对于原病毒DNA样本，需要没有初始的反转录（RT）反应，PCR反应可以直接启动。 加入40μl的PCR主要混合液至10微升provial脱氧核糖核酸。 PCR反应混合液在内务系统： 体积/反应（微升） 终浓度 无RNA酶H 2 O 15.4 5×缓冲液（HotStarTaq DNA聚合酶） 10 1个 5倍Q-解决方案 10 1个 dNTP混合物（10毫米） 2 400μM的每种dNTP 体酶混合物混合（HotStarTaq DNA聚合酶） 2 入门ENV-F（100μM） 0.3 0.6μM 入门ENV-R（100μM） 0.3 0.6μM ENV-F：的5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3“（nt的6556→6586） ENV-R：的5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3“（nt的7785←7811） 如先前所述的RNA样品（步骤3.1.4）运行的PCR条件。 4。巢式PCR扩增的V3区： 巢式PCR，用5微升的第一次PCR反应（不包括前面的分析中琼脂糖凝胶电泳）为模板，加入95微升的PCR MAS后混合。 嵌套在内务PCR预混 体积/反应（微升） 终浓度 H 2 O 61.9 10×PCR缓冲液 10 1个 5倍Q-解决方案 20 1个 dNTP混合物（10毫米） 2 200μM的每种dNTP 引物ENV-2F（100μM） 0.3 0.6μM 引物ENV-2R（100μM） 0.3 0.6μM HotStarTaq DNA聚合酶 0.5 2.5单位/反应 ENV-2F：5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC的3'（新台币6838→6864） <strong>环境-2R：5'-CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC的的-3“（nt的7712←7742） 运行的PCR如下： 93°C，15分钟 1个 95°C，30秒 50℃，30秒 72°C，90秒 1个 95°C，30秒 56℃，30秒 72°C，90秒 43× 72°C，10分钟 4°C∞ 分析的PCR产物在1％琼脂糖凝胶（图4）。预期的产品为902 bp的长。 测序的样品纯化。 用Qiagen公司的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，使用的协议，由供应商提供的解决方案和微柱。在30-100微升PE缓冲液洗脱，根据带的强度。 或者，可将样本用外切核酸酶我和快速AP（热碱性磷酸酶）。为了这个目的，添加6微升外AP混合到15微升的PCR产物，并孵育15分钟，在37℃。 580微升H 2 O 66微升的快速AP 13.4微升埃克索我 5。测序反应的V3扩增子测序反应由仅使用其中一个下列引物的PCR反应： ENV-2：5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC的的-3（nt的6959→6980） ENV-5：5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA – 3'（nt的7352←7371） ENV-6：5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC – 3'（新台币6979→7000） ENV-7：5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC – 3'（nt的7530←7549） ENV-10：5 – GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC – 3'（nt的7478←7507） 信封-11：5' – TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC – 3'（nt的7638←7664） 首选引物分别是：ENV-2，ENV-6或env-7，ENV-11 加入1μl纯化的V3扩增产物为模板，并添加9μl的PCR主混合。 测序主混音： 4μL的顺序混合（艾滋病毒基因分型试剂盒） 4微升H 2 O 1μl引物（100皮摩尔/微升） 运行序列反应如下： 96°C，持续10秒 50℃，10秒 36× 60℃，45秒 4°C∞ 6。测序的样品纯化净化序列USI吴经Sephadex G-50超细。 在“列装载器”，用Sephadex G-50超细填写适当数量的井。转移交联葡聚糖滤板MAHVN4510的翻身。 在过滤板，每孔加入300μl的Milli-Q H 2 O，下培养至少3小时，在2-8°C。 离心5分钟的板在910Xg和4-15℃。丢弃流过。 加入10μlH 2 O至序列的产品，然后移液管上的序列的溶胀的交联葡聚糖板。 为了获得纯化的产物，离心5分钟的板。在910Xg和4-15°C，并收集流过。 7。测序的测序仪ABI PRISM 3130 XL的纯化样品对每次运行之前，改变缓冲液和检查的聚合物（POP7）的体积。如果需要的话，由一个新的更换旧的聚合物烧瓶。 使用所保存的运行条件，包括注射时间为18秒。 在这台机器，采集的信号有16个序列样本数据的一个运行大约需要60分钟（36厘米毛细管）或150分钟（50厘米毛细管）。 8。序列编辑使用该程序Lasergene（DNA明星）对齐和编辑的序列（图5）。可以使用其他序列编辑程序。使用一个“V3-共识”B“和作为参考的 env一致序列。 Lasergene创建一个的共识序列分析样品所有的原始数据，并将其存储FASTA文件。的FASTA文件是一个文本文件，该文件包括一个标题用的样品和核苷酸序列的名称。 9。测序数据的解释和取向预测测序数据解释执行的基于Web的解释系统geno2pheno 辅助受体（ http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/的index.php）。对于嗜性预测，可以选择不同的FPR设置。默认设置是根据德国和奥地利的治疗指引。对于FPR≥20％，该病毒被归类时，作为R5 FPR≥20％和X4为FPR <12.5％。 FASTA文件上传到服务器。此服务器的核苷酸序列翻译成氨基酸，它与V3-共识B序列对齐，并产生一个亚型分类。此外，它会产生一个预测的辅助受体的使用（图4）为假阳性率（FPR）表示。 10。代表性的成果 geno2pheno 辅助受体输出显示了一个渐变的解释取向。根据使用的辅助受体的可能性，解释文本和背景颜色变化从绿色（FPR <20％），安全管理提出了MVC，地黄，暗示可能，风险低，最后到红色。红色是颜色建议ING不规定MVC。此外，服务器生成一个PDF格式的报告可以打印，填写病人的样本数据，发送给医生。的geno2pheno [辅助受体]输出的实施例描绘在图6。 图。 1。原理的HIV的复制。病毒颗粒细胞CD4受体结合，无论是作为辅助受体CCR5或CXCR4。辅助受体CCR5基因可以阻止CCR5拮抗剂如Maraviroc（MVC，Celsentri，Selzentry）。病毒和细胞的膜融合后，病毒核衣壳在细胞质中被释放。核衣壳拆卸和病毒RNA复合物被释放到细胞质中。病毒的逆转录酶（RT）的基因组RNA转录成原病毒DNA，然后被输送到细胞核，并整合入宿主基因组中的HIV整合。细胞RNA聚合酶TRAnscribe的前病毒基因组中的病毒基因组和信使RNA。产生的病毒蛋白在细胞质中，并输送到细胞表面。不成熟的，非感染性的病毒颗粒从细胞中的病毒颗粒芽。 HIV蛋白酶切割传染性微粒的蛋白质的生产。抑制的步骤之一导致中断的复制周期。 抗逆转录病毒药物和复制的步骤，他们抑制被标记为红色。 病毒RNA和绿色标记的前病毒DNA（所用材料趋向性或耐药性分析）。 图2。建立HIV前病毒基因组的 HIV颗粒具有不同的结构蛋白和房屋的各种酶和蛋白质，病毒和细胞。下图展示S的病毒的基因组内的基因的位置。表面蛋白gp120和gp41的病毒粒子的表面上，构成尖峰人体细胞联系来执行膜融合。的PCR扩增产物和我们的协议中使用的引物，在该图的下部，示出。 图3。低病毒载量（VL）的患者比例测量分析研究所病毒学大学，科隆（德国）的耐药性或嗜性的判断。 图4。总体方案的实验 ..请点击这里看到一个更大的版本，这个数字。 图5。序列编辑Lasergene V3的扩增子与至少一个正向和一个反向引物测序。 lasergene alignes“。阿比”的文件从音序获得与参考序列“V3-共识”B“和env。 ，Lasergene创建一个共识序列使用的所有行数据。可以被标记的参考序列（和然后以灰色显示），以便它们不有助于样品一致序列。 图6。归经预测报告所产生的geno2pheno [辅助受体工具。报告生成的PDF文件可以保存在电脑上完成。附加数据例如患者的姓名，血液提取，日期等，可手动包括使用的pdf作家程序。还可以添加具体意见。帖E数据完全是在用户的计算机和不上geno2pheno的[辅助受体]服务器。请点击这里看到一个更大的版本，这个数字。