Активация базофилов Тест для исследования IgE-опосредованной механизмов в наркотиках Гиперчувствительность
Summary
Базофилов активации теста является мощным инструментом для выявления IgE-зависимой аллергии<em> В пробирке</em>. Здесь, оптимизированный протокол для теста активации базофилов используется для исследования наркотиков гиперчувствительности. Метод эффективного производства ковалентных наркотиков белковые конъюгаты и их физико-химических характеристик описывается.
Abstract
Аллергические реакции на нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), как propyphenazone (ПП) и диклофенака (DF) могут проявляться как тип I типа аллергических реакций 1. В клинической практике диагноз лекарственной чувствительности в основном выполняются пациента истории, как кожная проба не является надежным и устного тестирования провокация медведи опасных для жизни риск для пациента 2. Таким образом, доказательство основной IgE-опосредованной pathomechanism трудно получить.
Здесь мы представляем в пробирке метод, основанный на использовании человеческих базофилов, полученных от незаконного-сверхчувствительных пациентов, который имитирует аллергические реакции эффектора в естественных условиях. Как базофилов лекарственно-аллергических больных нести IgE молекулы, специфичные для виновника наркотики, они становятся активируется при сшивания рецептор IgE и отпустите аллергические эффекторных молекул. Активация базофилов могут контролироваться с помощью определения регуляция CD63 поверхности выражения с помощью проточной цитометрии 3.
В случае низкого молекулярного веса наркотиков, конъюгаты которые созданы для IgE рецепторов сшивания на базофилы. Как показано на рисунке 1, двух представителей НПВП, РР и DF, ковалентно связаны с сывороточного альбумина человека (HSA) через карбоксильную группу, реагирующих с первичной аминогруппы остатков лизина. DF осуществляет внутреннюю карбоксильной группы и, таким образом, могут быть использованы непосредственно 4, тогда как карбоксильная группа содержащих производные ПП должно было быть синтезированы organochemically до исследования 1.
Связь степени низкомолекулярных соединений на молекулы белка-носителя и их пространственного распределения важно гарантировать сшивание двух молекул IgE рецептором. Описанный здесь протокол применяется высокопроизводительный-гель-хроматографии (HPSEC), оснащенный последовательным показателем преломления (RI) и ультрафиолетового (УФ) система обнаружения для определения степени связи.
Как описано методика может быть применена для других препаратов, тест активации базофилов (БАТ) несет потенциально могут быть использованы для определения IgE-опосредованные механизмы наркотиков гиперчувствительности. Здесь мы определяем ПП гиперчувствительности как IgE-опосредованной гиперчувствительности и DF, как не-IgE-опосредованной по НДТ.
Protocol
Discussion
НДТ устоявшихся хотя пока еще не широко используется метод диагностики IgE-опосредованные аллергические заболевания 6,7. Для приготовления гиперчувствительность, однако, возможность его применения снизился в низкомолекулярных соединений не в состоянии сшивки IgE рецепторов, предпосылкой для активации базофилов 8. Таким образом, препараты при расследовании должны быть ковалентно связаны с белками подходящий носитель (например, HSA). Важно отметить, что степень связи (т.е. количество наркотиков молекул на белок-носитель) должна находиться под контролем, чтобы гарантировать иммунологическую активность (т.е. IgE рецепторов сшивания) конъюгатов. Теоретически, два гаптенов за молекулой-носителем должна быть достаточной для рецепторов IgE сшивания и всего лишь пять DF молекул в HSA, как было показано, чтобы вызвать посредника выпуска в клеточной анализа 4. Оба конъюгатов, ПП-HSA и DF-HSA, были определены для отображения достаточно высокой степенью связи (HPSEC) и быть иммунологически активных делает их пригодными для использования реагентов в НИМ. Еще один вопрос, может быть, метаболитов наркотиков может играть роль, так как метаболита вместо исходного препарата может вызвать реакции гиперчувствительности. В случае DF, эта возможность была оценена подробно ранее с помощью пяти основных этапа I метаболитов и одна связь вариант 4. Важными факторами для освоения Описанная методика включает качество крови (<12 часов с момента забора крови, количество обнаруженных базофилов> 500) и оптимизации стимуляции условий (время, доза). Кроме того, так называемые, отказавшихся отвечать, которые даже не вступают в реакцию с положительным контролем (антитела, направленные против рецепторов IgE), должны быть идентифицированы. Таким образом, проверка критериев для включения анти-FcεRI антител в качестве положительного контроля. Важным преимуществом использования наркотиков конъюгатов является тот факт, что они появляются нетоксичным в отличие от чистых препаратов, как показано на DF-HSA сопряжены совместной стимуляции анти-FcεRI антител в BAT 4. Чистая DF, напротив, показывает цитотоксических эффектов при концентрации 1,25 мг / мл, возникают проблемы со интерпретируемости BAT 9. Как правило, тестирование для потенциальных цитотоксичность настоятельно рекомендуется для всех вновь произведенных наркотиков сопряжены.
Здесь мы показали потенциал PP-HSA сопряженных использоваться в BAT выявить IgE-опосредованной гиперчувствительности. В отличие от DF гиперчувствительности не связан с IgE свидетельствует отсутствие активации базофилов в ответ на DF-HSA сопряжены. Важно отметить, что в случае неопределенности в отношении IgE-опосредованной механизм, конъюгаты должны быть обследованы на иммунологическую активность в пробирке клеточных систем на основе анализа, как это было показано для DF 4.
Использование описанной установки сопряжения низкомолекулярные препараты вес ковалентно подходящим носителем белковых молекул число реакций гиперчувствительности против наркотиков в том числе антибиотиков, других НПВС, радиоконтрастного СМИ, миорелаксанты, анестетики и т.д., могут быть исследованы для участия IgE-опосредованной механизм. Таким образом, БАТ может служить дополнением к существующим методам диагностики (кожный тест, устное тестирование провокация).
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Австрийского фонда науки (ПВ) грант P18820-B13.
Этика заявление:
Исследование было одобрено (PLUS_Ethik_090514) в Комитет по этике для экспериментов с участием людей и / или животных в Университете Зальцбурга соблюдения Declaraction Хельсинки в редакции 1983 года и всех пациентов, участвующих дал свое письменное информированное согласие.
Materials
| Name of the reagent/device | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M3671 | – |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Bioscience | 08540 | – |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | 338962 | – |
| Bench top centrifuge | Sigma | – | – |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | D6899 | – |
| EDTA-Vacutainer | Becton Dickinson | 368589 | – |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett Packard | – | – |
| Human Serum Albumin | Sigma | A9511 | – |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | – | – |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma | E6383 | – |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | – |
| Propyphenazone derivative | Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Austria | – | – |
| Shaker | Eppendorf | – | – |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | – |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma | 90421C | – |
| Sodium hydroxid | Sigma | S5881 | – |
| Sodium phosphate | Sigma | 342483 | – |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | – |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | – |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | – |
References
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1–drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem – Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
