İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür
Summary
Burada kültür sıçan kortikal nöronların glial besleyici tabakasının varlığı için bir protokol sağlar. Kültürlü nöronlar polarite kurmak ve sinapslar oluşturmak ve glia elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme, hücre sağkalım deneyleri, immünhistokimya ve RNA / DNA / protein izolasyonu gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere ayrılabilir.
Abstract
Bu video glial besleyici bir tabaka, bir bilaminar ya da ko-kültür modeli olarak bilinen bir sistemin varlığı içinde kültür sıçan kortikal nöronların sürecinde size kılavuzluk edecektir. Bu sistem için uygun bir cam veya plastik büyüme substrat gerektiren çeşitli deneysel ihtiyaçlarını ve diğer tip nöron kültürü için de kullanılabilir.
Geç embriyonik evre (E17) elde Rat kortikal nöronların, cam lamelleri veya doku kültürü yemekleri besleyici tabaka, sırasıyla, yemekler ya da plastik lamelleri (manox olarak da bilinir) yetişen glia bir bakan kaplama. Özel deneysel gerekebilir kullanılan teknik, ya da iki yapılandırma arasında seçim bağlıdır, bu nöronların cam (örneğin kalsiyum görüntüleme karşı Western Blot) yetiştirilmektedir. Glial besleyici tabaka, karma glia bir astroglia zenginleştirilmiş ikincil kültür, ayrı ayrı, yeni doğmuş sıçan yavruların korteks (P2-4) nöronal önce hazırlanandiseksiyonu.
Nöronların bir kültür ile karşılaştırıldığında bu kültürü sisteminin en büyük avantajı sadece nöronal büyüme, hayatta kalma ve daha doğru in vivo beyin ortamında benzer glial besleyici tabaka, salgılanan trofik faktörler tarafından sağlanan farklılaşma destek. Ayrıca, ortak kültür, nöronal-glial etkileşimleri 1 incelemek için kullanılabilir .
Aynı zamanda, yerleşik diğer yöntemler 1 karşılaştırılabilir neredeyse saf nöronal bir tabaka önde gelen farklı yollarla (düşük yoğunluklu kültür, mitoz inhibitörleri Ayrıca, serum ve optimize edilmiş kültür ortamı kullanım eksikliği), nöronal tabaka glia kirlenme önlenir -3. Nöronlar, kültür sırasında herhangi bir zamanda kolayca glial tabakası ayrılır ve elektrofizyoloji 4, hücresel ve moleküler biyoloji 5-8, biyokimya 5, görüntüleme ve mikrofon arasında değişen farklı deneysel uygulamalar için kullanılır .roscopy 4,6,7,9,10. Bazı hücre hatları süreçleri uzatmak rağmen, fonksiyonel sinapsların 11 nöronal hücre hatlarında görülmez bir süreç oluşturmak için birincil nöronların akson ve dendritler uzanır.
Bu ortak kültür sistemi kullanılarak kültür sıçan hipokampal nöron ayrıntılı bir protokol daha önce 4,12,13 tarif edilmiştir. Burada ayrıntılı kortikal nöronların uygun modifiye edilmiş bir protokol. Yaklaşık 20×10 6 hücre, her bir sıçan embriyo kurtarıldı gibi, bu yöntem, nöronların (ama son derece homojen bir nöronal nüfus endişe) çok sayıda gerektiren deneyler için yararlıdır. Nöronlar ve glia hazırlanması planlanan bir zamanda belirli bir şekilde olması gerekir. Biz adım adım kültür sıçan kortikal nöronların için protokol yanı sıra kültür glial hücreler nöronlar destek sağlayacaktır.
Protocol
Discussion
Bu protokol nöronlar deneysel analizi için kolayca izole edilmesi için izin verirken, glia hücreleri varlığında kültür sıçan birincil kortikal nöronlar için bir yöntem sağlar. Sağlıklı bir nöronal fenotip glia destek gelişimi sırasında fizyolojik ilgili bir şekilde deneysel tedaviler de modüle nöronal cevapları. Ayrıca, böylece inflamatuar mikrogliyal stimülasyon önlenmesi, bu hücre popülasyonu seçici astrositlerde zenginleştirilmiş olur nöronlar kültür önce birincil glia Pasajlanm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu protokolün arıtma ve yıllar boyunca destek için NIH (DA19808 OM için DA15014) katkıda önceki laboratuar üyeleri teşekkür ederim. Anna Abt 1 "neuroAIDS Disiplinlerarası ve Translasyonel Araştırma Eğitimi" (T32-MH078795) bir adam, bu yüzden, bu çalışma, Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Servisi Ödülü 5T32MH079785 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Recherche Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Recherche |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Recherche Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Recherche Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Recherche Instruments |
11-1395 |
References
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
