DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

Schwab 외, EMBO J., 29 (4) :806 – 18 5. 방법은 다음과 같은 간행물에 사용되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. 1. DT40 세포 배양 자료 : 태아 소 혈청 (FBS), 닭 혈청, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 – 메르 캅 토 에탄올, RPMI 세포 배양 매체를 준비 : 7퍼센트 FBS를 추가 3% 닭 혈청, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 μm의 2 – 메르 캅 토 에탄올 RPMI 매체 있습니다. DT40 세포가 38 세에 무균 세포 배양 flasks에서 재배 ° C, 5 % 나 humidified 인큐베이터에서 CO 2. 5 × 10 5 세포 / ML 6 밀도 매일 세포를 분할. 2. 생체내 라벨에서 자료 : 이두, CldU 뉴클레오 티드 analogues의 재고 솔루션을 준비 : 중간 2.5 MM 5 MM과 CldU에 이두를 해산. 간단히 60 두 솔루션을 열 ° C와 뉴클레오 티드 아날로그까지 소용돌이ues 완전히 녹아있다. 기하 급수적으로 DT40 세포 성장을 25 μm의의 최종 농도 이두를 추가하고 잘 세포 현탁액을 섞는다. 38 ° C와 5% CO 2에서 20 분 동안 세포를 품어. 첫 번째 레이블이있는 부화 후, 250 μm의의 최종 농도 CldU을 추가하고 이전 단계에서 설명한대로 세포를 처리합니다. 얼음 차가운 PBS로 세포를 씻어 및 7.5 × 10 5 세포 / 차가운 PBS에서 ML의 농도에 그들을 resuspend. 얼음에 표시된 세포 보관하십시오. 설명 라벨 절차는 단순히 제안하고 구체적인 질문을 해결하기 위해 수정할 수 있습니다. 실험 설계에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. 3. 확산 세포 용해와 DNA 재료 : 유리 슬라이드, 섬유 용해 용액 200 MM 트리스 – HCL, pH를 7.5에서 50 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 0.5 % SDS : 섬유 용해 용액 준비 <li유리 슬라이드의 한쪽 끝을에 세포 현탁액의> 스팟 2 μl. 5 분하거나 드롭의 볼륨까지 공기 건조가 크게 감소하지만, 건조하지 않습니다. Pipet 7 μl 용해 세포 현탁액 위에 솔루션과 부드럽게 솔루션을 혼합하는 피펫 팁 함께 저어. 진행 세포 용해 2 분 동안 품어. 섬유는 슬라이드를 따라 확산 수 있도록 15 °로 슬라이드를 기울. 섬유 솔루션은 슬라이드의 하단에 도달되면, 공기 건조에 수평으로 그것을 놓으십시오. 건조 후, 얇은, 불투명한 라인은 슬라이드 따라 표시되어야합니다. 이 시점에서 뻗어 섬유의 시작은 라인이 더 이상 표시되지 않습니다 얼룩 이후로 연필로 표시한다. 이 마크는 나중에 현미경으로 섬유를 찾습니다 도움이 될 것입니다. 4. Immunofluorescence 염색법 자료 : 메탄올, 초산, HCL, PBS에서 5 % BSA, 얼룩 병, 안티 – BrdU (마우스) 항체,안티 BrdU (쥐) 항체, 양 반 마우스 Cy3 항체, 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 항체, Vectashield 장착 매체, coverslips, 매니큐어 메탄올 / 10 분 얼룩 병 및 부화에 초산 (3시 1분)에 빠져 슬라이드. 80분 2.5 M HCL에 다음 젖어 소주 H 2 O에서 슬라이드를 씻으십시오. 워시는 5 분 동안 PBS로 세 번 슬라이드. 얼룩의 항아리에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 여분의 PBS를 수집합니다. 수평 슬라이드를 놓고 각 슬라이드의 상단에 pipet 5 % BSA. 슬라이드 위에 균일하게 BSA를 확산하고 20 분 동안 부화 coverslip와 함께 부드럽게 슬라이드를 커버. 1시 25분 안티 BrdU (마우스)와 1:400 안티 BrdU (쥐) : 다음과 같은 농도에서 5 % BSA의 기본 항체를 희석. 그것을 제거하는 유리 슬라이드 아래로 부드럽게 coverslip를 이동합니다. 커버 슬립이 슬라이드 경우엔 힘을 적용하지 마십시오. coverslip 줄을 될 때까지 슬라이드는 PBS에 rehydrated 수 있습니다D는 쉽게 제거할 수 있습니다. 종이 타월로 여분의 BSA를 수집하고 가로 슬라이드를 삽입합니다. 각 슬라이드에 기본 항체 솔루션의 Pipet 50 μl. 슬라이드 위에 균일하게 항체 솔루션을 확산하고 2 시간 동안 humidified 챔버에서 부화 coverslip로 다시 커버. coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻어 1:500 양 반 마우스 Cy3와 1:400 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 다음 농도에서 5 % BSA의 보조 항체를 희석. 로 기본 항체에 대한 설명 보조 항체 용액 50 μl를 적용합니다. 1 시간 동안 조명과 부화에서 슬라이드를 보호합니다. coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻는다. 각 슬라이드에 Vectashield 장착 매체의 한 방울을 추가하고 coverslip을 적용합니다. 부드럽게 coverslips을 누르면 종이 타월로 여분의 주위에 액체를 제거합니다. 투명 손톱 polis과 인감 coverslips그들이 건조 H 및하자. -20 ° C.에있는 슬라이드를 저장 5. 이미지 수집 재료 : 형광 현미경, 카메라 연필 표시에 가​​까운 슬라이드에 침지 기름 한 방울을 장소와 섬유를 찾기 시작합니다. 일반적으로, 그곳에서 주요 섬유 번들이지만,이 섬유가 너무 얽혀 버린하고 나중에 분석할 수 없습니다. 섬유가 명확하게 (그림 2) 서로 분리 영역을 찾기 위해 멀리 기본 번들에서 이동합니다. 우리는 편견을 피하기 위해 한 색상 채널을 사용하여 사진을 선택합니다. 그렇다면, 우리는 매번 포인트, 집중력 또는 셀 라인의 약 10 사진을 찍는 것입니다. 그러나 사진의 숫자는 각 사진에 계산 수있는 얼마나 많은 섬유에 따라 달라집니다. 슬라이드 중 하나가 지역 대표 섬유 길이 또는 복제 구조를 제공하지 수 있으므로, 다른 사진을 찍을 수있는 슬라이드를 따라 이동합니다. 6. 데이터 분석 <p class="jove_content"> 재료 : 그림 분석 프로그램, 예를 들어 ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) 사진 분석 프로그램에 사진을 가져옵니다. 섬유 책자 및 / 길이를 측정하거나 (그림 3) 서로 다른 복제 구조를 계산합니다. 단지 그림의 가장자리를 통해 연장하지 명확하게 표시하고있는 아르 섬유를 계산합니다. 우리는 일반적으로 약 100 섬유의 길이를 측정하고 150-200 복제 구조를 계산하고 우리는 각각의 실험에 적어도 세 번 반복합니다. 7. 대표 결과 : 새로 복제된 DNA는 항체 – 레이블 염기 analogues의 라인으로 시각하실 수 있습니다. 우리의 실험에서 지속적인 분기점이 인접 빨간색과 초록색 신호 (그림 3)로 표현된다. 이중 레이블 프로토콜은 또한 우리가 복제 구조의 네 개의 주요 클래스를 정의할 수 있습니다 : 1) 새로운 초기화 이벤트가 divid 수 있습니다 세포가 처음으로 라벨과 두 번째 레이블 인큐베이션 기간 동안 해고 기원 incubated 동안 해고 기원에 에드. 전자 인근 녹색 빨강 – 녹색 신호와 녹색 라인만을 후기 구성되어 있습니다. 2) 종료 이벤트는 인접한 빨강 – 녹색 – 빨간색 신호로 명단. 3) interspersed 기원이 붙어 기원과 게놈의 사이트입니다. 이러한 사이트는 연속 기원과 종료 신호로 구성됩니다. 4) 지연 / 붕괴 포크는 하나만을 빨간 신호를 7 또는 짧은 녹색 넓이 8,9 다음 붉은 선으로 정의 될 수 실험 설계에 따라 다릅니다. 조건을 사용하면 야생 유형 DT40 세포가 0.4 μm의 / 분 평균 포크 속도를 가지고, 여기에 설명되어 있습니다. 우리는 약 63%에게 지속적인 포크, 10 % 기원, 16% 지연 포크 (적색 전용 책자), 8 % 종단 3 % interspersed 섬유를 검색할 수 있습니다. ure 1 "/> . 그림 1 (A) 만화의 왼쪽은 DNA 라벨 절차의 첫 단계를 묘사 : 기하 급수적으로 증가하고 DT40 세포 이두를 추가하면 즉시 새로 합성 선도와 DNA의 긴 보온에 통합될 수있는 뉴클레오 티드 아날로그을 주도하고 있습니다. 이것은 특정 항체를 사용하여 시각 수 있으며, 현미경으로 볼 때 붉은 선으로 나타납니다. 그림의 오른쪽에있는 그림과 같이 그 후, 동일한 절차 CldU로 반복됩니다. 두 번째 뉴클레오 티드 아날로그와 부화 후, 적극적인 포크 인접한 빨강 – 녹색 넓이로 표시됩니다. 평균 섬유 길이는 염기 analogues의 배양 시간에 비례합니다. (B) lysed DT40 세포에서 DNA는 현미경 슬라이드에 중력에 의해 늘어 및 법인 염기 analogues은 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 시각 점입니다. igure 2 "/> 그림 2. 대표 형광 이미지는 이후 이십분 각 이두와 CldU으로 표시 야생 유형 DT40 세포에서 섬유를 보여줍니다. 섬유의 대부분은 잘 서로 구분하기 때문에 쉽게 분석할 수 있습니다. 하얀 막대는 10 μm의를 나타냅니다. . 그림 3 이중 라벨 섬유 기술은 하나가 다른 복제 구조를 구분할 수 있도록, 1 – 적극적으로 복제 포크, 2 – DNA 복제 (새 기원의 발포), 3의 새로운 사이트 – 포크 종단 (두 수렴 포크), 4 – interspersed 섬유 (붙어있는 기원의 장소) 및 5 – 지연 포크 (적색 신호 전용).