使用可视化的DNA复制DNA纤维的技术，在脊椎动物的模型系统DT40

在这里介绍的方法是使用下列出版物：Schwab等，EMBO J.，29（4）:806 – 18 5。 1。 DT40细胞培养 材料：胎牛血清（FBS），，鸡血清，青霉素/链霉素，2 -巯基乙醇的RPMI 准备细胞培养液中添加7％FBS，3％的鸡血清，1个青霉素/链霉素和10微米2 – 巯基乙醇的RPMI培养基。 DT40细胞生长在无菌细胞培养瓶中，在38 ° C和5％CO 2在培养箱。拆分单元格，每天密度5 × 10 5细胞/ ml 6。 2， 在体内的标签 材料：IDU，CldU 准备核苷酸类似物的股票解决方案：解散IDU在中等至2.5毫米至5毫米和CldU。热两种解决方案简要地60 ° C和旋涡，直到核苷酸类似物UES完全溶解。 IDU添加到终浓度为25微米成倍增长DT40细胞和混合细胞悬液。细胞孵育20分钟，38 ° C和5％CO 2 。 第一个标签的潜伏期后，添加CldU到终浓度为250微米，并视为在上一步中所描述的细胞。 与冰冷的PBS清洗细胞，在浓度7.5 × 10 5细胞/ ml的冷PBS重悬。标记的细胞置于冰上。 标签过程仅仅是一个建议，可以进行修改，以解决具体问题。实验设计的更多信息，请参阅讨论部分。 3。细胞裂解和DNA的蔓延 材料：载玻片，纤维裂解液准备纤维裂解液：在200毫米的Tris – HCl，pH 7.5的50 mM的EDTA，0.5％SDS <lispot 2μl的细胞悬液到载玻片的一端。空气干燥5分钟或直到下降的体积大大减少，但不干燥。 吸取7μl的细胞悬液上裂解液，轻轻搅动枪头混合的解决方案。孵育细胞裂解进行2分钟。 15 °倾斜的幻灯片，让纤维传播沿着幻灯片。 一旦光纤解决方案已经达到底部的幻灯片，水平放置风干。干燥后，薄，不透明的线应沿幻灯片可见。此时，应开始拉伸纤维染色线将不可见，再后用铅笔标​​记。此标记稍后将有助于找到的纤维在显微镜下。 4。免疫荧光染色 材料：甲醇，醋酸，盐酸，5％bsa的pbs，染色缸，抗brdu抗体（鼠），抗brdu抗体（鼠），羊抗鼠cy3标记抗体，羊抗鼠的alexa fluor 488抗体，vectashield安装介质，盖玻片，指甲油沉浸在甲醇醋酸（3:1）在染色缸和10分钟的孵育幻灯片。 在蒸馏水中h 2 o的幻灯片，然后在2.5 m盐酸浸泡80分钟洗净。 5分钟，洗净幻灯片在pbs的3倍。 从染色缸中删除的幻灯片，并用纸巾收集多余的pbs。水平放置幻灯片和吸管5％bsa的每张幻灯片上。轻轻盖上盖玻片的幻灯片，传播的bsa均匀地分布在幻灯片和孵育20分钟。 淡化在5％bsa在以下浓度的主要抗体：1​​:25抗brdu（鼠标）和1:400抗brdu（大鼠）。 向下移动载玻片盖玻片，轻轻将其删除。不要使用武力，如果盖玻片坚持幻灯片。在pbs直到盖玻片变得松散一个幻灯片可水化d可以轻松删除。用纸巾收集多余的bsa和横向放置幻灯片。吸取50μl抗体溶液到每个幻灯片。盖上盖玻片，再次传播的抗体溶液均匀地分布在幻灯片和在2个小时的湿盒孵育。 取出的盖玻片后，洗的幻灯片，在pbs三次5分钟以下浓度稀释在5％bsa的二级抗体：1:500羊抗小鼠cy3和1:400羊抗鼠的alexa 488。 应用50μl二次抗体的主要抗体所述的解决方案。防止光线和孵化1小时的幻灯片。 取出的盖玻片后，5分钟洗幻灯片在pbs的3倍。 添加到每个幻灯片下降vectashield安装介质和应用盖玻片。轻压盖玻片，并围绕它用纸巾去除多余的液体。与透明的指甲城邦密封盖玻片h和让他们干。存放于-20 ° c的幻灯片 5。图像采集 材料：荧光显微镜，相机放置浸油下降到接近铅笔标记的幻灯片，并开始定位的纤维。通常情况下，有一个主要的纤维束，但这些纤维太纠结，以后不能分析。离主束纤维明确由对方（图2）分离领域。我们将选择的图片，只用一个颜色通道，以避免偏见。然后，我们将采取约10每个时间点，浓度或细胞株的照片。然而，图片的数量取决于多少纤维可以计算每一张图片上。沿着采取不同的图片幻灯片，幻灯片的一个区域可能无法提供有代表性的纤维长度或复制结构。 6。数据分析<p class ="“jove_content”"> 材料：图片分析程序，例如：ImageJ （ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ） 导入的图片分析程序图片。测量长度的纤维束和/或计数不同的复制结构（图3）。只算纤维清晰可见，不扩展到画面边缘。我们通常约100纤维长度测量和计数150-200复制结构，我们将至少三次重复个别实验。 7。代表性的成果： 新复制的DNA可以可视化的抗体标记的核苷酸类似物线。在我们的实验正在进行叉代表相邻的红色和绿色信号（图3）。双标协议还允许我们定义的复制结构的四个主要类别：1）新的启动事件可以divid到发射的起源，而细胞培养与第一个标签，并在第二个标签的潜伏期发射的起源。前者包括邻近的绿 – 红 – 绿信号，后者只有一条绿线。 2）终止事件表现为毗邻的红，绿，红色信号。 3）穿插的起源是在过密的起源基因组中的网站。这类网站包括连续的起源和终止信号。 4）根据实验设计，停顿/倒塌叉可以定义为一个红色的7只信号或一条红线很短的绿道8,9。 这里所描述的条件，野生型DT40细胞中有一个叉速度平均为0.4微米/分钟。我们可以探测到约63％正在进行的叉子，10％起源，16％陷入僵局叉（红色大片），8％终端和3％穿插纤维。 余吕杏茜1“/> 。图1（a）左侧的卡通描绘的DNA标记程序的第一步：加入IDU指数增长DT40细胞，导致容易被纳入到新合成的领先和落后的DNA链的核苷酸类似物。这可以通过使用特定的抗体进行可视化，并在显微镜下观察时，会出现一条红线。随后，同样的过程重复与CldU上图的右侧所示。第二个核苷酸类似物的潜伏期后，积极叉将作为毗邻的红，绿道可见。纤维平均长度是核苷酸类似物孵育时间成正比。 （二）从裂解DT40细胞的DNA是由重力拉伸到载玻片和注册成立的核苷酸类似物是利用特异性抗体和荧光显微镜观察。 igure 2“/> 图2代表的荧光图像显示了从野生型DT40随后与IDU和CldU标记，每次20分钟的细胞纤维。纤维大多是彼此分开，因此可以很容易地分析。白条代表10微米。 图3双标纤维技术允许一个区分不同的复制结构; 1 -积极复制叉，2 -新网站的DNA复制（发射新的起源），3 -叉终止（两个汇聚成叉），4 -穿插纤维间隔紧密的起源（站点）和5 – 停滞叉（红色信号）。