Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

El método descrito aquí se utilizó en la siguiente publicación: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 de cultivo celular Materiales: suero fetal bovino (FBS), suero de pollo, la penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI Preparar el medio de cultivo celular: añadir el 7% de SFB, el 3% suero de pollo, la penicilina 1x / estreptomicina y 10 mM 2-mercaptoetanol al medio RPMI. DT40 células se cultivan en frascos de cultivo celular estéril a 38 ° C y 5% de CO 2 en un incubador humidificado. Dividir celdas cada día a una densidad de 5 x 10 5 células / ml 6. 2. En vivo etiquetado Materiales: UDI, CldU Preparar soluciones madre de los análogos de nucleótidos: disolver UDI a 5 mm y CldU a 2,5 mm de media. Calentar las soluciones brevemente a 60 ° C y agitar hasta que el análogo de los nucleótidosUES se disuelven por completo. Añadir UDI a una concentración final de 25 mM de crecimiento exponencial de las células DT40 y mezclar la suspensión celular también. Se incuban las células durante 20 minutos a 38 ° C y 5% CO 2. Después de la incubación con la primera etiqueta, añada CldU a una concentración final de 250 M y el tratamiento de las células como se describe en el paso anterior. Lavar las células con PBS enfriado con hielo y resuspender ellos en una concentración de 7,5 x 10 5 células / ml en PBS frío. Mantener las células marcadas en el hielo. El procedimiento de etiquetado descrito es sólo una sugerencia y puede ser modificado para responder a preguntas específicas. Por favor refiérase a la sección de discusión para obtener más información sobre el diseño experimental. 3. Lisis celular y el ADN difusión Materiales: láminas de vidrio, fibra de solución de lisis Prepare la solución de lisis de fibra: 50 mM EDTA y SDS al 0,5% en 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 <lipunto> 2 l de la suspensión celular a un extremo de la lámina de vidrio. Deje secar al aire durante 5 minutos o hasta que el volumen de la caída se reduce considerablemente, pero no secas. Pipeta de solución de lisis 7 l en la parte superior de la suspensión celular y revuelva suavemente con la punta de la pipeta para mezclar las soluciones. Incubar durante 2 minutos para la lisis celular para continuar. Inclinación de diapositivas a 15 ° para permitir que las fibras se extienden a lo largo de la diapositiva. Una vez que la solución de fibra ha alcanzado la parte inferior de la diapositiva, coloque horizontalmente para secar al aire. Después del secado, una delgada línea, opaco debe ser visible a lo largo de la diapositiva. En este punto, el inicio de las fibras estiradas se debe marcar con un lápiz como después de la tinción de la línea no será visible por más tiempo. Esta marca posterior le ayudará a localizar las fibras en el microscopio. 4. La tinción de inmunofluorescencia Materiales: metanol, ácido acético, ácido clorhídrico, 5% de BSA en PBS, jar manchas, anti-BrdU (ratón) de anticuerpos,anti-BrdU (ratón) de anticuerpos de oveja anti-ratón Cy3 anticuerpo de cabra anti-rat Alexa Fluor 488 anticuerpos, Vectashield medio de montaje, cubreobjetos, esmalte de uñas Sumerja los portaobjetos en metanol / ácido acético (3:1) en una cubeta y se incuba durante 10 minutos. Lavar los portaobjetos en agua destilada H 2 O, y luego sumergirse en 2,5 M de HCl durante 80 minutos. Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos. Retirar los portaobjetos de la cubeta y recoger el exceso de PBS con una toalla de papel. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal y BSA pipeta de 5% en la parte superior de cada diapositiva. Cubrir los portaobjetos suavemente con un cubreobjetos para difundir la BSA de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuba durante 20 minutos. Diluir los anticuerpos primarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:25 anti-BrdU (ratón) y 1:400 anti-BrdU (rata). Mover el cubre suavemente el portaobjetos de vidrio para eliminarlo. No aplicar la fuerza si la hoja de la cubierta se adhiere a la diapositiva. La diapositiva puede ser rehidratada en PBS hasta que el cubreobjetos se suelta unad se puede quitar con facilidad. Recoger BSA exceso con una toalla de papel y la desliza horizontalmente. Pipeta de 50 l de la solución de anticuerpo primario en cada diapositiva. Cubrir de nuevo con un cubreobjetos para difundir la solución de anticuerpos de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuban en una cámara húmeda durante 2 horas. Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos Diluir los anticuerpos secundarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:500 de oveja anti-ratón Cy3 y 1:400 de cabra anti-rat Alexa Fluor 488. Aplique 50 l de la solución de anticuerpo secundario como se describe para los anticuerpos primarios. Proteger a las diapositivas de la luz y se incuba durante 1 hora. Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos. Agregar una gota de medio Vectashield montaje en cada diapositiva y colocar un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y eliminar el exceso de líquido alrededor de ella con una toalla de papel. Sello cubreobjetos con uñas transparente polish y déjelos secar. Tienda de las diapositivas a -20 ° C. 5. De adquisición de imágenes Materiales: cámara microscopio de fluorescencia, Ponga una gota de aceite de inmersión en un portaobjetos cerca de la marca del lápiz y empezar a localizar las fibras. Por lo general, hay un haz de fibras principales, pero estas fibras son demasiado enredado y no puede ser analizado más adelante. Aléjese del paquete principal para encontrar áreas en las que las fibras están claramente separados el uno del otro (Fig. 2). Queremos seleccionar las imágenes que sólo utiliza un canal de color con el fin de evitar el sesgo. Luego, tomaría aproximadamente 10 imágenes de cada línea de tiempo del punto, la concentración o celular. Sin embargo, el número de imágenes depende de muchas fibras se pueden contar en cada imagen. Se mueven a lo largo de la diapositiva para tomar las fotos diferentes, como un área de la diapositiva no puede proporcionar la longitud de fibra o de las estructuras representativas de replicación. 6. Análisis de datos <p class="Jove_content"> Materiales: Imagen del programa de análisis, por ejemplo, ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) Importar imágenes en un programa de análisis de imagen. Medir las longitudes de los tramos de fibra y / o el recuento de las estructuras de reproducción diferentes (Fig. 3). Sólo cuentan las fibras que son claramente visibles y que no se extienden sobre el borde de la imagen. Por lo general medir la longitud de alrededor de 100 fibras y el recuento de 150 a 200 estructuras de reproducción y que se repiten los experimentos individuales por lo menos tres veces. 7. Los resultados representativos: ADN recién replicado se puede visualizar como líneas de anticuerpos marcados con análogos de nucleótidos. En nuestros experimentos un tenedor en curso se representa como adyacentes señales rojas y verdes (Fig. 3). El protocolo de doble etiquetado también nos permite definir cuatro tipos principales de estructuras de repetición: 1) nuevos eventos de iniciación se puede divi ed los orígenes que han disparado mientras que las células se incubaron con la primera etiqueta y origen que se han disparado durante la incubación con la segunda etiqueta. Los primeros constan de vecinos verde-rojo-verde de señales y el último de una línea verde solamente. 2) eventos de terminación se manifiestan como al lado de color rojo-verde-rojo señales. 3) origen entremezclados son los sitios en el genoma de origen muy próximas entre sí. Tales sitios constan de orígenes consecutivos y señales de terminación. 4) en función del diseño experimental, se estancó / horquillas colapsado se puede definir como una señal en rojo sólo el 7 o una línea roja seguida de una zona verde de 8,9 a corto. Usando las condiciones descritas aquí, las células de tipo salvaje DT40 tienen una velocidad promedio de tenedor de 0,4 m / min. Podemos detectar aproximadamente el 63% se bifurca en curso, el origen del 10%, 16% de las horquillas se estancó (rojo vías únicamente), terminaciones 8% y 3% de fibras entremezcladas. La figura 1 "/> . Figura 1 (A) El lado izquierdo de la caricatura representa el primer paso del procedimiento de marcaje de ADN: la adición de UDI de crecimiento exponencial de las células DT40 conduce el análogo de nucleótido que se incorpora fácilmente a la líder de nueva síntesis, y quedando las hebras de ADN. Esto puede ser visualizado mediante el uso de un anticuerpo específico, y aparecerá como una línea roja cuando se observa bajo el microscopio. Posteriormente, el mismo procedimiento se repite con CldU como se muestra en la parte derecha de la figura. Después de la incubación con el análogo de los nucleótidos en segundo lugar, un tenedor de activos será visible como un adjunto rojo-verde las vías. La longitud de fibra media es proporcional a la duración de la incubación de los análogos de nucleótidos. (B) de ADN de las células lisadas DT40 se estira por la gravedad sobre un portaobjetos de microscopio y los análogos de nucleótidos incorporados son visualizados por el uso de anticuerpos específicos y microscopía de fluorescencia. igura 2 "/> Figura 2. Una imagen de fluorescencia muestra representativa de las fibras de tipo salvaje células DT40 posteriormente etiquetados con UDI y CldU durante 20 minutos cada uno. La mayoría de las fibras están bien separadas unas de otras y por lo tanto se puede analizar con facilidad. La barra blanca representa el 10 micras. . Figura 3 La técnica de fibra de doble etiquetado permite distinguir entre las estructuras de reproducción diferentes, 1 – horquillas de replicación activa, 2 – los nuevos sitios de replicación del ADN (lanzamiento de nuevos orígenes), 3 – terminaciones tenedor (dos tenedores de convergencia), 4 – fibras entremezcladas (lugares de orígenes muy próximas entre sí) y 5 – las horquillas se estancó (sólo señal de color rojo).