ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום הבא: שוואב ואח', EMBO ג', 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 תא תרבות חומרים: בסרום שור עוברית (FBS), עוף בסרום, פניצילין / סטרפטומיצין, 2-mercaptoethanol, RPMI הכן התרבות התא בינוני: להוסיף FBS 7%, עוף בסרום 3%, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -10 מיקרומטר 2-mercaptoethanol עד בינוני RPMI. DT40 התאים גדלים צלוחיות תרבות סטרילי התא ב 38 ° C ו 5% CO 2 בתוך חממה humidified. פיצול תאים מדי יום צפיפות של 5 x 10 5 תאים / מ"ל 6. 2. תיוג בשנת vivo חומרים: IdU, CldU הכינו מלאי של פתרונות אנלוגים נוקלאוטיד: להמיס IdU עד 5 מ"מ ו – 2.5 מ"מ CldU בינוני. מחממים שתי פתרונות בקצרה עד 60 ° C ו מערבולת עד אנלוגי נוקלאוטידיםUES מתמוססים לחלוטין. הוסף IdU לריכוז סופי של 25 מיקרומטר עד גדל באופן אקספוננציאלי DT40 תאים לערבב את ההשעיה תא היטב. דגירה התאים למשך 20 דקות ב 38 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר הדגרה עם התווית הראשונה, להוסיף CldU לריכוז סופי של 250 מיקרומטר ולטפל תאים כפי שמתואר בשלב הקודם. שטפו תאים עם קרח קר PBS ו resuspend אותם בריכוז של 7.5 x 10 5 תאים / מ"ל בקור PBS. שמור את התאים שכותרתו על הקרח. ההליך המתואר תיוג הוא רק הצעה והוא יכול להיות שונה כדי לענות על שאלות ספציפיות. נא עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על עיצוב ניסיוני. 3. Cell ו-DNA תמוגה מתפשטת חומרים: שקופיות זכוכית, תמוגה פתרון סיבים הכן את הפתרון תמוגה סיבים: 50 mM EDTA ו – SDS 0.5% ב 200 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5 <li> 2 ספוט μl של השעיה התא בקצה אחד של שקופיות הזכוכית. אוויר יבש במשך 5 דקות או עד נפח של טיפת מופחת במידה ניכרת, אך לא יבש. 7 Pipet פתרון μl תמוגה על גבי ההשעיה תא ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה לערבב את הפתרונות. דגירה של 2 דקות תמוגה התא כדי להמשיך. הטיה שקופיות ° 15 על מנת לאפשר הסיבים להתפשט לאורך השקופית. לאחר פתרון סיבים הגיע לתחתית המגלשה, למקם אותו אופקית אוויר יבש. לאחר ייבוש, קו דק, אטום צריך להיות גלוי לאורך השקופית. בשלב זה, תחילת סיבים נמתח יש לסמן בעיפרון כמו אחרי מכתים הקו לא יהיה גלוי יותר. סימן זה יהיה מאוחר לעזור לאתר את סיבי מתחת למיקרוסקופ. 4. Immunofluorescence מכתים חומרים: מתנול, חומצה אצטית, HCl, BSA 5% ב-PBS, צנצנת מכתים, אנטי BrdU (העכבר) נוגדן,אנטי BrdU (עכברוש) נוגדנים, אנטי עכבר כבשים Cy3 נוגדן, אנטי עכברוש עז אלקסה נוגדן 488 פלואוריד, בינוני Vectashield הרכבה, coverslips, לק מגלשות לטבול מתנול / חומצה אצטית (03:01) בצנצנת מכתים ו דגירה במשך 10 דקות. לשטוף שקופיות מזוקקים H 2 O, לטבול אז HCl 2.5 M עבור 80 דקות. לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות. הסר שקופיות מתוך הצנצנת מכתים ולאסוף PBS עודף עם מגבת נייר. מניחים את השקופיות אופקית BSA pipet 5% על גבי שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם coverslip להפיץ את BSA באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה במשך 20 דקות. לדלל את הנוגדנים העיקרי BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:25 אנטי BrdU (עכבר) ו 1:400 אנטי BrdU (חולדה). הזז את coverslip מעדנות שקופיות הזכוכית כדי להסיר אותו. אין להפעיל כוח אם להחליק כיסוי במקלות לשקופית. שקופית ניתן rehydrated ב PBS עד coverslip הופך רפויד ניתן להסיר בקלות. איסוף עודפי BSA עם מגבת נייר במקום שקופיות אופקית. 50 Pipet μl של הפתרון נוגדן ראשוני על כל שקופית. מכסים שוב עם coverslip להפיץ את הפתרון נוגדנים באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה בתא humidified למשך 2 שעות. לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות לדלל את נוגדנים משני BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:500 כבשים אנטי עכבר Cy3 ו 1:400 עז אנטי עכברוש אלקסה פלואוריד 488. החלת 50 μl של הפתרון נוגדנים משני כמתואר עבור נוגדנים ראשוניים. הגנו על שקופיות אור דגירה במשך שעה 1. לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות. הוסף ירידה של המדיום Vectashield גובר על כל שקופית ולהחיל coverslip. לחץ בעדינות על coverslips ולהסיר את הנוזלים העודפים מסביב עם מגבת נייר. חותם coverslips שקוף עם מסמר פוליס שעות ולתת להם יבש. אחסן את השקופיות ב -20 ° C. 5. תמונה הרכישה חומרים: מצלמה פלואורסצנטי, מיקרוסקופ מניחים טיפת שמן טבילה לשקופית קרוב כדי לסמן את העיפרון ולהתחיל באיתור סיבים. בדרך כלל, יש צרור סיבים הראשי, אבל סיבים אלה הם הסתבכו מדי ולא ניתן לנתח מאוחר יותר. להתרחק צרור הראשי כדי למצוא אזורים שבהם סיבים מופרדים בבירור זה מזה (איור 2). היינו לבחור תמונות רק באמצעות ערוץ אחד צבע כדי למנוע הטיה. לאחר מכן, היינו לוקחים כ 10 תמונות של כל קו הזמן, נקודת ריכוז או התא. עם זאת, מספר התמונות תלוי איך סיבים רבים ניתן לספור על כל תמונה. תתקדמי השקופית כדי לקחת את התמונות השונות, כמו אזור אחד של שקופית לא יכול לספק אורכי סיב נציג או שכפול מבנים. 6. ניתוח נתונים <p class="Jove_content"> חומרים: ניתוח תמונה תוכנית, למשל ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ייבוא ​​תמונות לתוך תוכנית ניתוח התמונה. מדוד את אורכי של קטעי סיבים ו / או לספור את המבנים שכפול שונים (איור 3). רק לספור סיבים אשר גלויים לעין ואשר לא להאריך מעבר לקצה של התמונה. אנחנו בדרך כלל למדוד את אורך של כ 100 סיבים לספור 150-200 מבנים שכפול והיינו חוזרים ניסויים בודדים לפחות שלוש פעמים. 7. נציג תוצאות: ה-DNA משוכפל חדש ניתן דמיינו כקווים של נוגדן הנקרא אנלוגים נוקלאוטיד. בניסויים שלנו מזלג מתמשך מיוצג אותות אדום וירוק סמוך (איור 3). פרוטוקול תיוג כפול גם מאפשר לנו להגדיר ארבע כיתות העיקריים של שכפול מבנים: 1) אירועים חדשים ייזום ניתן divid עורך אל המקורות כי ירו בעוד התאים הודגרו עם התווית הראשונה המקורות כי ירו במהלך הדגירה עם התווית השנייה. הראשון מורכב ירוק אדום ירוק אותות השכנות השנייה של קו ירוק בלבד. 2) אירועים סיום להתבטא אדום ירוק אדום אותות סמוכים. 3) מקורות וביניהם אתרים בגנום עם מקורות צפופים. אתרים אלה כוללים מקורות ברציפות אותות סיום. 4) בהתאם לעיצוב הניסוי, נתקע / מזלגות התמוטט יכול להיות מוגדר כאיתות רק 7 אדום או קו אדום ואחריו בדרכי ירוק קצר 8,9. שימוש בתנאים המתוארים כאן, תאים מסוג בר DT40 יש מזלג מהירות ממוצעת של 0.4 מיקרומטר / min. אנחנו יכולים לזהות כ 63% מזלגות מתמשך, מקורותיה 10%, מזלגות נתקע 16% (שטחים רק אדום), הפסקות 8% סיבים שזורים 3%. יור 1 "/> . איור 1 (א) בצד השמאלי של הקריקטורה מתארת ​​את השלב הראשון של ההליך תיוג DNA: הוספת IdU אל DT40 התאים גדל באופן אקספוננציאלי מוביל את אנלוגי נוקלאוטיד להיות משולב בקלות לתוך המוביל מסונתז החדש ואת מפגרת גדילי דנ"א. זה יכול להיות דמיינו באמצעות נוגדן ספציפי, יופיע קו אדום כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ. כתוצאה מכך, הליך אותו הוא חזר עם CldU כפי שמוצג בצד ימין של הדמות. לאחר הדגרה עם אנלוגי נוקלאוטידים השני, מזלג פעיל יהיה גלוי כמו בדרכי אדום ירוק הסמוך. אורך סיב ממוצע הוא יחסי זמן הדגירה של אנלוגים של נוקלאוטידים. (ב) דנ"א DT40 תאים lysed נמתח על ידי כוח הכבידה לשקופית מיקרוסקופ ואת אנלוגים נוקלאוטיד משולבים הם דמיינו ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי. igure 2 "/> באיור 2. תמונה הקרינה נציג מראה סיבים בר DT40 תאים סוג שכותרתו לאחר מכן במשך 20 דקות כל אחד עם IdU ו CldU. רוב הסיבים מופרדים היטב אחד מהשני ולכן יכול להיות מנותח בקלות. הבר לבן מייצג 10 מיקרומטר. . איור 3 הטכניקה תיוג פעמיים סיבים מאפשר להבחין בין מבנים שכפול שונים; 1 – מזלגות שכפול פעיל, 2 – אתרים חדשים של שכפול הדנ"א (ירי מקורות חדשים), 3 – הפסקות מזלג (שני מזלגות מתכנסים), 4 – סיבים שזורים (אתרים של מקורות צפופים) ו 5 – מזלגות נתקע (אות רק אדום).