Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

BÖLÜM I: Patojen TANIMLANMASI 1. Numune Hazırlama Not: aşağıdaki protokol açıklandığı gibi tüm moleküler iş akışı moleküler tanı kalite güvencesi 3 önerileri doğrultusunda yapılmalıdır. A 1:10 seyreltilmiş örnek olmak için 1.5 ml'lik tepkime tüp içine% 0.9 NaCl 0.9 ml kan bir kültür 0.1 ml bir örnek ekleyin. (Seyreltilir qPCR inhibisyonu önlemek için). Pelet 5 dk bakteriyel DNA 13400 xg'de örnek santrifüjleyin. 100 ul steril demineralize H 2 O bakteri pelletini 4 ° C ye kadar daha fazla kullanımda DNA örneği saklayın. 2. Tanımlama Testi: Real-time PCR 16s rDNA Aşağıdaki gibi reaksiyon karışımı hazırlayın. Assay numune başına dört ayrı reaksiyonlar meydana gelir. Her karışım 12.50 ul ana içerirkarışım, 0.9 uM ileri astar (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0.6 uM ters astar (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 ve probları bir panel. Prob miktarı aşağıda yer alan dört ayrı reaksiyonların her biri için verilmiştir. İlk tepki içerir: 0.2 uM evrensel bir sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 0.2 uM P. aeruginosa prob (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) İkinci reaksiyon içerir: 0.2 uM E. coli prob (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) 0.2 uM Pseudomonas spp. Sondaya (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) Üçüncü reaksiyonu içerir: 0.2 uM Staphylococcus spp. Sondaya (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) 0.2 uM S. aureus prob (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) 0.2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) Dördüncü reaksiyonu içerir: 0.2 uM evrensel bir sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 0.3 uM Streptococcus spp. Sondaya (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) 0.2 uM S. pneumoniae prob (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) 20 ul toplam hacimde ulaşmak için steril demineralize H2O ekleyin. Bir 96-kuyulu plakanın PCR kuyucuklara Her reaksiyon karışımı 20 ul ekleyin. Her bir kuyucuğa örnek 5 ul ekleyin. 96-PCR plakanın damgalanması yapışkan film kullanın. Aşağıdaki en iyi termal siklus koşullarını kullanarak ABI PRISM 7900HT Real Time PCR Sistemi plaka çalıştırın: 10 dakika süre ile 50 ° C de ön-ısıtma 15 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon 42 döngü 15 sn 95 ° C 'de denatürasyon 1 dakika boyunca 60 ° C'da tavlama 3. Sonuçların Analizi Sekmesi Analiz Ayarlar 0.1 Ct Analiz eşiği ayarlayın. 6 ve End (Cycle): 15 Başlat temel yapılandırmaları (Cycle) daraltın. Tüm numuneler için döngüsü eşiği (Ct) değerini kaydedin. Pozitif bir PCR sonucu dikkate cut-off değeri 35 bir Ct-değere ayarlanabilir. Kan kültürlerinde mevcut bakteri miktarı Ct-değerleri 35 altında üreten, 10 7 10 11 CFU / ml arasında değişmekteydi. BÖLÜM II: ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ 4. Pozitif Kan Kültürleri 9 Bakteri İzolasyonu Pozitif kan kültürü şişe suyu 5 ml aspire ve serum ayırıcı tüpüne aktarın. 10 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje serum ayrıştırıcı tüp. Serum ayırıcı tüpten atılır. Transferi bacTeria steril pamuklu ile tüp jel tabakası den% 0.9 'luk tuzlu su içine bir 0,5 McFarland standart bir süspansiyon elde edilinceye kadar. 5.. Mikro Titre Tabaklar Aşılanması 5 x 10 5 CFU / ml 'lik bir süspansiyon oluşturmak üzere çift konsantre Mueller Hinton II çorbasındaki 0,5 McFarland süspansiyonu ile seyreltilir. Antibiyotikler (Tablo 1) bir seçim içeren bir mikro titre plakanın kuyularına Bu süspansiyon ekleyin. 6 saat süreyle 37 ° C 'de mikro titre plakası inkübe. 4 ° C (negatif büyüme kontrolü gibi) de süspansiyon bir kısım saklayın. İnkübasyonun 6 saat sonra, steril bir tüp içinde, her sıra bir içerik transfer gibi olumsuz büyümesini kontrol örneği 4 ° C de muhafaza edildi olduğu 5 dakika boyunca 16.000 g'de santrifüje borular. Dikkatle bakteriyel pelet bozmadan, süpernatant kaldırın. Steril demineralize H pelletini <sub> 2 O. Steril demineralize H 2 O 10 kat örnekleri sulandırınız 6. Real-time PCR 16'lar rDNA 10 Aşağıdaki gibi PCR karışımı hazırlandı: 12.50 ul iQ SYBR Green Supermix İleri 0,5 uM astar 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 0.25 uM ters primer 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 20 ul toplam hacme steril demineralize H2O Bir 96-kuyulu plakanın PCR kuyucuklara PCR karışımı 20 ul ekleyin. Her bir kuyucuğa örnek 5 ul ekleyin. 96-PCR plakanın damgalanması yapışkan film kullanın. Aşağıdaki optimum ısı bisiklet şartları kullanarak, MyiQ Tek Renk Real-Time PCR Algılama Sistemi plaka çalıştırın: 4 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon İlk ° C'de 30 saniye 65 tavlama 35 döngü 9 denatürasyon15 sn için 5 ° C 1 dakika boyunca 60 ° C'da tavlama (° C 0.57 ° C lik artışlarla birlikte 20 dakika içinde 60-95 arası) eğrisi analizi eritin 7. Sonuçların Analizi Aşağıdaki formül (antibiyotik türüne bağlı olarak) birini kullanarak kesme Ct değeri hesaplanır. Genel olarak: Cut-off Ct değeri = Ct değeri pozitif büyüme kontrolü + 0.5 x (Ct değeri negatif büyüme kontrolü – Ct değeri pozitif büyüme kontrolü) Piperasilin, piperasilin / tazobaktam ve Gram-negatif çubuklar seftazidim; Amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim / sulfametoksazol S.aureus, Enterococcus spp Amoksisilin:. Cut-off Ct değeri = Ct değeri pozitif büyüme kontrolü + 0.25 x (Ct değeri negatif büyüme kontrolü – Ct değeri pozitif büyüme kontrolü) Pozitif büyüme kontrol olarak steril demineralize H 2 O ile inkübe örnek kullanın. Mikroorganizma bağlı olarak, uygun negatif büyüme kontrolü kullanın: Gram-negatif çubukları örnek antibiyotik karışımı ile inkübe Enterococcus spp. Örnek 4 ° C'de saklandı S.aureus Örnek 4 ° C'de saklandı Duyarlılığı (S) ya da aşağıdaki gibi test antibiyotik için suşunun direnç (R) belirleyin: Cut-off Ct değeri daha yüksek bir Ct değeri duyarlılık gösterir Cut-off Ct değeri daha düşük bir Ct değeri direnç gösterir 8. Temsilcisi Sonuçlar İki model organizmalar, Gram-negatif E. yani coli ve Gram-pozitif S. aureus, bakteriyel patojenler ve bunların antimikrobiyal profilinin belirlenmesi algılama ve tanımlama için kombine prosedür görselleştirmek için seçilir. Protokolünün birinci bölümü patojen bir tanıtımım içerir. Specific probları sekiz klinik mikroorganizmaların saptanması için tasarlanmıştır. Bakteriyel paneli dahil bir hedef varlığında, amplifikasyon eğrileri olarak oluşturulur ve Ct değerleri (Şekil 2) hesaplanır. Pozitif bir PCR sonucu dikkate cut-off değeri 35 bir Ct değeri ayarlanır. Şekil 2A, bir E.coli-enfekte kan kültür tanımlama profili gösterilmiştir. 16S evrensel prob iki ayrı reaksiyon karışımlarının içerdiği ve dolayısıyla iki amplifikasyon eğrileri (25.20 ve 25.95 Ct) üretir. Üçüncü sinyal E. için belirli bir prob türetilmiştir coli (27.04 Ct). Bir S. tanımlama aureus-enfekte kan kültürü Şekil 2B 'de gösterilmiştir. 16S evrensel prob 33.35 ve 33.71 amplifikasyonu sinyalleri vardır. Kalan iki sinyalleri Staphylococcus spp için özel problar türetilmiştir. ve S. aureus (32.48 ve 30.59 Ct). <p class = "jove_content"> protokolünün birinci bölümü sonra etken mikroorganizmanın bilinmektedir ve antimikrobiyal profili tespit edilebilir. Şekil 3 de gösterilmiştir E.coli strain temsil eden bir antibiyotik duyarlılık testi amplifikasyon plot, örnek olarak Şekil 2A. Her bir hat bakteriyel örnek ile inkübe edildi olduğu bir antibiyotik temsil eder. Düşük bir Ct değeri ile bir örnek büyüme test antibiyotik için bir antibiyotik, direnç gösteren varlığında oluştu olduğu bir örnektir. Tersine, bir yüksek CT değeri, herhangi bir gelişme, çünkü test antibiyotiğe antibiyotik, hassasiyet gösteren etkili bir çalışma ile meydana gelmiş olan bir örneği gösterir. Tablo 1, E. antimikrobiyal profilini gösterir belirlenmesi coli ve S. aureus izolatlarının. Tüm Ct değerlerini bildirdi ve protokol metni (7.1) 'de belirtilen formülleri kullanarak, iki kesme Ct değerlerini hesaplanan vardır edilirdirenç ve duyarlılık ayırt yonunun. Bildirilen CT değeri hesaplanmıştır cut-off CT değeri (ya da tam tersi) 'den daha düşük olması durumunda deformasyon antibiyotiğe dirençli. RDNA PCR gerçek zamanlı 16S kullanarak patojen tanımlanması ve antibiyotik duyarlılık testi prosedürü Şekil 1. Akış çizelgesi. Şekil 2 Tanımlama testi:. Amplifikasyon araziler ve döngüsü eşik değerleri (Ct değerleri) spesifik problar nedensel patojenin tanımlanması için kullanılan ise pozitif kan kültürü, evrensel 16S rDNA sensörü tarafından algılanır.. Kan kültürü A. amplifikasyonu arsa E. içeren coli, S. içeren kan kültüründe B. amplifikasyonu arsa aureus; Pseu ae, Pseudomonaeruginosa gibi; uni, 16S evrensel probu; ecoli, Escherichia coli probu; Pseu sp, Pseudomonas spp. probu; S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae probu; Strep sp, Streptococcus spp. probu; Entero, Enterococcus spp. probu; S. aureus, Staphylococcus aureus probu; Staph sp, Staphylococcus spp. prob. Bir E. antibiyotik duyarlılık testi Şekil 3. Amplifikasyon arsa coli (örnek 1) izole eder. Her eğrisi şekil değiştirme ile inkübe edildi olduğu bir antibiyotik temsil eder. Erken bir sinyal suşu test antibiyotik varlığında büyümüş ve antibiyotiğe dirençli ve böylece anlamına gelir yüksek bir bakteri yükü, kaynaklanır. Geç sinyalleri suşu antibiyotik varlığında yetiştirilen olmadığını göstermektedir, diğer bir deyişle, bu hassastır. <tbody> Örnek 1: E. coli Örnek 2: S. aureus AST Ct R / S AST Ct R / S Amoksisilin 8 mg / L 16,83 R Amoksisilin 0.25 mg / L 21,03 R Amoksisilin-klavulanat 8/4 mg / L 17,36 R Oksasilin 2 mg / L 25,80 S Piperasilin 16 mg / L 16,67 R Vankomisin 2 mg / L 25,20 S Piperasilin-tazobaktama 16 /4 mg / L 24,15 S Gentamisin 4 mg / L 25,86 S Ciprofloxacin 1 mg / L 29,72 S Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L 24,62 S Seftazidim 1 mg / L 24,03 S Seftazidim 8 mg / L 26,58 S Gentamisin 4 mg / L 29,83 S Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L 27,60 S Negatif büyüme kontrolü (antibiyotik karışımı) 30,41 Negatif büyüme kontrolü (örnek 4 ° C'de saklanır) 27,42 Pozitif büyüme kontrolü 16,90 Pozitif büyüme kontrolü 20,22 Cut-off Ct-değeri 1 * 21,76 Cut-off Ct-değeri 1 *** 23,82 Cut-off değeri Ct-2 ** 18,75 Cut-off Ct-değeri 2 **** 22,02 * Amoksisilin, amoksisilin-klavulanat, siprofloksasin, gentamic içintrimetoprim-sulfametoksazol, içinde ** Piperasilin, piperasilin-tazobaktama, seftazidim için Vankomisin ve gentamisin için *** **** Amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim-sulfametoksazol için Tablo 1. İki örnek (E.coli ve S.aureus) antibiyotik duyarlılık testi belirlenmesi. PCR testinin Ct değerleri otomatik olarak protokol metninde gösterilen formüller kullanılarak, pozitif ve negatif büyüme kontrolü gelen iki kesim Ct alues ​​hesaplar hangi olarak, bu excel dosyası kopyalandı. Bir antibiyotik cut-off Ct değerinden daha düşük bir değere Ct gösterirse CT değeri cut-off 'den daha yüksek ise, suşu, antibiyotiğe dirençli, strain hassastır.