יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

חלק ראשון: זיהוי פתוגן 1. לדוגמא הכנת הערה: העבודה המולקולרי כולו מתואר בפרוטוקול הבא יש לבצע על פי המלצות אבטחת איכות אבחון מולקולרי 3. הוסף aliquot 0.1 מ"ל של תרבית דם ל 0.9 מ"ל 0.9% NaCl לתוך צינור 1.5 התגובה מ"ל להיות מדגם מדוללת 1:10. (לדלל כדי למנוע עיכוב QPCR). סרכזת מדגם ב XG 13400 5 דקות כדי גלולה DNA חיידקי. Resuspend גלולה החיידקים 100 μl סטרילית מזוקקים H 2 O. לאחסן את דגימת DNA על השימוש ° C עד 4 יותר. 2. Assay זיהוי: בזמן אמת 16-rDNA ה-PCR להכין את תערובת התגובה כדלקמן. Assay מורכבת מארבעה תגובות נפרדות לדגימה. התערובת כוללת שני 12.50 μlתערובת, 0.9 מיקרומטר קדימה פריימר (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0.6 מיקרומטר צבע יסוד הפוכה (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 ו פאנל של בדיקות. הסכום של בדיקות ניתנת לכל אחד מארבעת תגובות נפרדות להלן. התגובה הראשונה כוללת: 0.2 בדיקה אוניברסלית מיקרומטר (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 0.2 מיקרומטר פ aeruginosa בדיקה (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) התגובה השנייה כוללת: 0.2 מיקרומטר א ' בדיקה coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) 0.2 מיקרומטר Pseudomonas spp. בדיקה (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) תגובה 3 כוללת: 0.2 מיקרומטר Staphylococcus spp. בדיקה (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) 0.2 מיקרומטר ס בדיקה aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) 0.2 מיקרומטר אנטרוקוקוס spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) תגובה 4 כולל: 0.2 בדיקה אוניברסלית מיקרומטר (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 0.3 מיקרומטר סטרפטוקוקוס spp. בדיקה (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) 0.2 מיקרומטר ס דלקת ריאות בדיקה (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) הוסף סטרילית מזוקקים H 2 O להגיע בנפח כולל של 20 μl. הוסף 20 μl של תערובת כל תגובה הבארות של הצלחת ה-PCR 96-היטב. הוסף 5 μl של הדגימה היטב כל אחד מהם. השתמש בסרט הדבקה כדי לאטום את הצלחת גם 96-PCR. הפעל את הצלחת על 7900HT PRISM ABI מערכת בזמן אמת באמצעות PCR התנאים הבאים אופטימליים רכיבה תרמית: טרום חימום על 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות Denaturation ראשוני על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות 42 מחזורים של Denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות חישול על 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 3. ניתוח של התוצאות התאם את סף ניתוח ה-CT כדי 0.1 בהגדרות ניתוח טאב. צמצם את התצורות הבסיסיות להתחיל (מחזור): 6 ו End (מחזור): 15. רשום את סף המחזור (CT) ערך עבור כל הדגימות. ערך חתך לשקול תוצאה PCR חיובי ניתן להגדיר ערך-CT של 35. כמות החיידקים הנמצאים תרבויות דם נע בין 10 יולי – 10 נובמבר CFU / ml, ה-CT ליצור ערכי מתחת ל -35. חלק ב: בדיקות רגישות אנטיביוטי 4. בידוד של חיידקים מתרבויות דם חיוביות 9 Aspirate 5 מ"ל של מרק מן הבקבוק דם חיובית התרבות ולהעביר אותו לתוך צינור מפריד בסרום. בצנטריפוגה צינור מפריד סרום XG ב 2000 ל 10 דקות. מחק supernatant מהצינור מפריד בסרום. העברת BACteria של שכבת ג'ל של הצינור עם מטלית כותנה סטרילי לתוך מי מלח 0.9% עד 0.5 ההשעיה מק 'פרלנד רגיל מתקבל. 5. חיסון של צלחות מיקרו Titre לדלל את ההשעיה 0.5 מק 'פרלנד ב כפול מרוכז מילר Hinton II מרק להקים ההשעיה של 5 X 10 5 CFU / ml. להוסיף את ההשעיה על בארות צלחת titre מיקרו המכיל מבחר של אנטיביוטיקה (טבלה 1). דגירה צלחת titre מיקרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות. אחסן aliquot של השעיה על 4 מעלות צלזיוס (כמו בקרת צמיחה שלילית). לאחר 6 שעות של דגירה, להעביר את התוכן של כל אחד גם לתוך צינור סטרילי, כמו גם בקרת צמיחה שלילית מדגם שהיה מאוחסן ב 4 ° C. בצנטריפוגה צינורות ב XG 16000 דקות 5. מוציאים בזהירות את supernatant, מבלי להפריע גלולה חיידקי. Resuspend גלולה ב H מזוקקים סטרילית <sub> 2 א ' לדלל את הדגימות 10 של פי סטרילית מזוקקים H 2 O. 6. בזמן אמת 16-rDNA ה-PCR 10 מכינים את תערובת PCR כדלקמן: 12.50 μl iQ SYBR גרין Supermix 0.5 מיקרומטר קדימה תחל 16S-1 (5 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 0.25 מיקרומטר פריימר 16S-2 הפוך (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 סטרילית מזוקקים H 2 O ל בהיקף כולל של 20 μl הוסף 20 μl של תערובת PCR על בארות צלחת PCR 96-היטב. הוסף 5 μl של הדגימה היטב כל אחד מהם. השתמש בסרט הדבקה כדי לאטום את הצלחת גם 96-PCR. הפעל את הצלחת על מערכת אחת, צבע MyiQ PCR בזמן אמת איתור, באמצעות התנאים הבאים אופטימליים רכיבה תרמית: Denaturation ראשוני על 95 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ראשוני חישול ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות 35 מחזורים של Denaturation ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות חישול על 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ממיסים ניתוח עקומת (60-95 מעלות צלזיוס ב 20 דקות עם במרווחים של 0.57 ° C) 7. ניתוח של התוצאות לחשב את ערך חתך Ct באחת הנוסחאות הבאות (בהתאם לסוג של אנטיביוטיקה). באופן כללי: ניתוק Ct ערך = ct צמיחה חיובית ערך Control + 0.5 x (CT צמיחה שלילית ערך השליטה – Ct שליטה חיובית ערך גידול) Piperacillin, piperacillin / tazobactam ו ceftazidime ב גראם שליליים, מוטות, אמוקסיצילין, oxacillin ו trimethoprim / sulfamethoxazole ב S.aureus: אמוקסיצילין ב אנטרוקוקוס spp. Cut-off Ct ערך = ct צמיחה חיובית ערך Control + 0.25 x (צמיחה Ct ערך שלילי בקרה – בקרה חיובית Ct ערך גידול) השתמש במדגם מודגרות עם סטרילית מזוקקים H 2 O כמו בקרת צמיחה חיובית. בהתאם מיקרואורגניזם, להשתמש בשלט המתאים צמיחה שלילית: גראם שלילי לדוגמא מוטות מודגרות בתערובת של אנטיביוטיקה אנטרוקוקוס spp. לדוגמה לאחסן על 4 מעלות צלזיוס לדוגמא S.aureus מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס לקבוע את הרגישות (S) או התנגדות (R) של המתח על אנטיביוטיקה נבדק באופן הבא: Ct ערך גבוה מערך ה-CT חתוכים עולה הרגישות Ct ערך נמוך יותר מאשר ערך ה-CT חתוכים מציין התנגדות 8. נציג תוצאות שני אורגניזמים מודל, כלומר גראם שלילי א coli ו גראם חיובי ס aureus, נבחרו כדי להמחיש את התהליך המשולב לגילוי וזיהוי של חיידקים פתוגנים וקביעת פרופיל מיקרוביאלית שלהם. חלקו הראשון של פרוטוקול כולל זיהוי הפתוגן. SPE בדיקות cific נועדו לצורך זיהוי של שמונה מיקרואורגניזמים רלוונטיות קלינית. במעמד של יעד כלל בלוח חיידקי, עקומות הגברה נוצרים ערכים מחושבים ה-CT (איור 2). ערך חתך לשקול תוצאה PCR חיובי מוגדר הערך CT של 35. איור 2 א, פרופיל זיהוי של תרבות E.coli-נגוע הדם מוצג. בדיקה 16S אוניברסלית כלול שני תערובות התגובה נפרדות וכתוצאה מכך יוצרת שתי עקומות הגברה (CT של 25.20 ו 25.95). האות השלישית נגזרת ספציפית בדיקה עבור ה coli (CT של 27.04). זיהוי של ס ' aureus, נגוע בתרבות הדם מוצג באיור 2 ב. בדיקה 16S אוניברסלית יש אותות הגברה של 33.35 ו – 33.71. שני האותות הנותרים נגזרות בדיקות ספציפיות עבור Staphylococcus spp. וס ' סטפילוקוקוס (CT של 32.48 ו 30.59). <p class =""> "jove_content" אחרי החלק הראשון של הפרוטוקול, מיקרואורגניזם סיבתי ידוע הפרופיל מיקרוביאלית ניתן לקבוע. איור 3 הוא דוגמה העלילה הגברה בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה, המייצג את המתח E.coli שהוקרן גם ב איור 2 א. כל שורה מייצגת 1 אנטיביוטי כי המדגם חיידקי הודגר עם. לדוגמה עם ערך נמוך Ct דוגמה שבה הצמיחה התרחשה בנוכחות התנגדות, אנטיביוטיקה המציין לאנטיביוטיקה נבדק. להיפך, ערך גבוה Ct מייצג מדגם שבו הצמיחה לא חל בגלל עבודה יעילה של רגישות, המציין אנטיביוטיקה לאנטיביוטיקה נבדק. טבלה 1 מדגימה את קביעת הפרופיל מיקרוביאלית של א ' coli וס ' aureus מבודד. כל ערכי ה-CT מדווחות, באמצעות הנוסחאות שהוזכרו בטקסט Protocol (7.1), שני חתוכים ערכי ה-CT הם calculated להבחין בין התנגדות הרגישות. זן עמיד לאנטיביוטיקה אם הערך דיווח CT הוא נמוך יותר מאשר ערך מחושב Ct חתוכים (ולהיפך). 1. תרשים זרימה תרשים של זיהוי הפתוגן הליך בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות בזמן אמת 16S rDNA PCR. איור 2 assay זיהוי:. מגרשים הגברה סף מחזור וערכים (ערכי ה-CT) תרבית דם חיובית הוא זוהה על ידי 16S rDNA בדיקה אוניברסלית, ואילו בדיקות מסוימות משמשים לזיהוי של הפתוגן סיבתי.. עלילה א 'הגברה של תרבית דם המכיל א coli, העלילה ב 'הגברה של תרבית דם המכיל ס aureus, Pseu AE, Pseudomonכמו aeruginosa, חד, 16S בדיקה אוניברסלית; Ecoli, Escherichia coli בדיקה; Pseu SP, Pseudomonas spp. בדיקה: ס pneu, Streptococcus pneumoniae בדיקה, דלקת SP, סטרפטוקוקוס spp. בדיקה: Entero, אנטרוקוקוס spp. בדיקה: ס aureus, Staphylococcus aureus בדיקה; Staph SP, Staphylococcus spp. בדיקה. 3. איור הגברה העלילה של בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה של א ' coli לבודד (לדוגמה 1). העקומה מייצגת 1 אנטיביוטי כי זן הודגר עם. איתות מוקדם נגרמת על ידי עומס חיידקי גבוה, כלומר, המתח גדל בנוכחות אנטיביוטיקה נבדק והוא עמיד ובכך אנטיביוטי. אותות המאוחרות עולה כי המתח לא גדלה בנוכחות אנטיביוטיקה, במילים אחרות, הוא רגיש. <tbody> דוגמה 1: א ' coli דוגמה 2: ס aureus AST CT R / S AST CT R / S אמוקסיצילין 8 מ"ג / ל ' 16,83 R אמוקסיצילין 0.25 מ"ג / ל ' 21,03 R Amoxicillin-clavulanate 8/4 מ"ג / ל ' 17,36 R Oxacillin 2 מ"ג / ל ' 25,80 S Piperacillin 16 מ"ג / ל ' 16,67 R Vancomycin 2 מ"ג / ל ' 25,20 S Piperacillin-tazobactam 16 /4 מ"ג / ל ' 24,15 S גנטמיצין 4 מ"ג / ל ' 25,86 S ציפרופלוקסאצין 1 מ"ג / ל ' 29,72 S Trimethoprim-sulfamethoxazole 2/38 מ"ג / ל ' 24,62 S Ceftazidime 1 מ"ג / ל ' 24,03 S Ceftazidime 8 מ"ג / ל ' 26,58 S גנטמיצין 4 מ"ג / ל ' 29,83 S Trimethoprim-sulfamethoxazole 2/38 מ"ג / ל ' 27,60 S צמיחה שלילית השליטה (תערובת של אנטיביוטיקה) 30,41 צמיחה שלילית השליטה (לדוגמה לאחסן על 4 מעלות צלזיוס) 27,42 צמיחה חיובית השליטה 16,90 צמיחה חיובית השליטה 20,22 חתוכים CT-ערך 1 * 21,76 חתך CT-הערך 1 *** 23,82 חתוכים CT-הערך 2 ** 18,75 חתך CT-הערך 2 **** 22,02 * לקבלת אמוקסיצילין, amoxicillin-clavulanate, ציפרופלוקסאצין, gentamicב, trimethoprim-sulfamethoxazole עבור ** piperacillin, piperacillin-tazobactam, ceftazidime עבור *** vancomycin ו גנטמיצין **** עבור אמוקסיצילין, oxacillin ו trimethoprim-sulfamethoxazole טבלה 1. קביעת בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה של שתי דגימות (E.coli ו S.aureus). ערכי ה-CT של PCR-assay הועתקו לקובץ Excel זו, כפי שניתן מחשב באופן אוטומטי את שני חתוכים alues ​​ה-CT משליטת צמיחה חיובית או שלילית, תוך שימוש בנוסחאות שמוצגות הטקסט פרוטוקול. אם אנטיביוטיקה מראה Ct ערך נמוך יותר משווי ה-CT חתוכים, זן עמיד לאנטיביוטיקה, אם הערך Ct היה גבוה יותר מאשר ניתוק, זן רגיש.