Аутологичных эндотелиальных клеток-предшественников-Посев Технология и Биосовместимость Тестирование Для сердечно-сосудистой устройства в Большой Модель животных

1. Эндотелиальных клеток-предшественников изоляции Тридцать дней до EPC-посеян трубки имплантации, готовят 60 мл шприц с 15 мл антикоагулянта цитрат декстрозы решения и безопасный с 3-х ходовой кран для ЕРС изоляции из периферической крови свиньи. За 24 часов до крови рисовать, намывной два 12-луночных планшетах с 1 типа крыса коллагена (50 мкг / мл, растворенный в 0,02 н раствор уксусной кислоты) 4. Поведение всех ухода за животными и эксперименты в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и только после одобрения надзора Институциональные уходу и использованию животных комитета. Седативный женщин Йоркшир свиней (45 кг) с Acepromazine (1,1 мг / кг) и кетамина (22 мг / кг) с помощью внутримышечной иглой 19 G бабочки. Интубировать свинья с эндотрахеальной трубки (30 см длиной, 8 мм ID) и обезболить свинья с изофлюрана (4,5% от дыхательного объема по маске). Монитор свиньи во время процедуры путем измерения насыщения крови кислородом, частоты сердечных сокращений и температуры. Поддерживать терморегуляции с помощью автоматизированной подогревом операционный стол и отопления одеялом и при нагревании придают жидкости. Место кота в положении лежа на операционном столе, обеспечить его задние конечности caudolaterally, и чистый с Хлоргексидин следуют DuraPrep стерилизации. Затем приступить драпировки тазовой области. Вставьте 21 G х 7 см иглу из 5 F микро-интродьюсер комплект просто медиальнее бедренной ощутимым импульсом (медиальнее vastus медиальной и латеральной к мышце гасШз) в бедренную вену иглу и вены с использованием Сельдингера техники. Подключите подготовлены 60 мл шприца внутрисосудистого катетера и привлечь 45 мл крови. Держите давление на сайте судна прокол для достижения гемостаза (5 мин), следует прекратить анестезии и восстановить свиньи. Животное отслеживается до полного восстановления и вернулся в свою клетку. Развести крови решение 1:1 с буферный раствор соли Хэнка (без CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) и слой на равных объемов Histopaque для создания четко определенных слоев. Центрифуга (30 мин, 740 г, низкое значение перерыва) и собирать мононуклеарных клеток (МНК) слоя. Ресуспендируют и мыть МНК х 3 с фосфатом Дульбеко буферного раствора (DPBS) (10 мин, 515 г), прежде чем покрытие на два 12-луночных планшетах в полной питательной среде (ДМ-2 среде с 2% свиной сыворотки (PS) и EGM-2 SingleQuots) при 37 ° C, 5% СО 2. Медленно изменение среды каждые 24 часа в течение первых 7 дней, затем через день. Определить EPC колоний после среднее время от 7 дней (рис. 2). Развернуть ЕРС в культуре как только они покрывают четверть 12-а площадью поверхности. Подтвердите EPC идентичность с проточной цитометрии путем проверки на наличие поверхностных маркеров CD31 и отсутствие CD14, CD45. Другие анализы, которые могут быть выполнены включают морфологии клеток и оксид азота III активность после воздействия потока 4. 2. Титан трубкой Раздел трубки Ti продольно на 3 равные 120 градусов единиц (4,5 см в длину) с 72 зубами HHS резки видел удерживается на месте увидели беседка в вертикальный фрезерный станок. Запустите его на 300 оборотов в минуту и держать лесосеки насыщенный Нажмите Магия смазочно-охлаждающая жидкость в течение всего времени резания (рис. 3). Польский внутренней поверхности с мясорубки скамейке и Scotch-Brite металлообработки колеса. Затем вручную полируют наждачной бумагой 3M дальнейшего гладкой и ровной поверхности, чтобы удалить все видимые ямы. Чистый титан куски с решением Алконокс мылом, затем 5 минут погружения в царской водке (1:3 концентрированной азотной кислоты в концентрированной соляной кислоты), с последующей промывкой с несколькими литрами воды 10. Проявлять крайнюю осторожность, как царская водка является сильно едким веществом и взрывоопасной! Разрушать ультразвуком Ti разделы х 16 мин в растворе Алконокс мыло, поднимайтесь х 30 в деионизированной воды и снова разрушать ультразвуком х 16 мин в деионизованной воде. Дайте высохнуть в ламинарный поток капот. Вырезать из ПВХ термоусадочные трубки до 4,5 см в длину и тщательно очистить в 2,4. Используйте пинцет, чтобы место 3 очищены Ti разделы на поддержку оправки (изготовлены из алюминия, диаметр 8,5 мм) и поместите рукав ПВХ термоусадочной трубки вокруг разделы Ti (рис. 4). Термоусадочная трубка с тепловой пушки во время поворота оправки равномерно обернуть Ti разделы тесно вместе. 3. Устройство Посевная и сборки компонентов Вырезать силиконовые трубки в длину 2,5 см и 3,5 см. Раздел 5 мл пластиковый шприц на 0,8 мл марку и сохранить "головной убор" Луер с конца. Тщательно очистите 2 х силиконовых разделы: "головной убор" шприц и крышка Луер ультразвуком как описано в разделе 2.4. Добавить силиконовые трубки на каждом конце трубки Ti собран с 2,5, расширенийдинь на 5 мм на трубы из ПВХ. Вставьте обрезанный конец "головной убор" шприца в короткие трубки силиконовые, так что он примыкает Ti трубки (рис. 5). Печать готового Ti трубкой с одним Луер колпачок в сумке Tyvek и газа стерилизации окисью этилена (18 часов при 55 ° С). Горы синхронного двигателя сроки (10 РПХ) на оргстекло платформу и подключить его оси до шприца держатель (обрабатываемых из алюминия, подходит 5 мл шприц) (рис. 6). 4. EPC-посев Ti внутренней поверхности трубки Развернуть ЕРС как изолированные в возрасте до 1. Сливающийся до 3 Т-75 колб (или, по крайней мере, 9 х 10 6 клеток). В день операции, флуоресцентно этикетке клетки с долгосрочными красителя (PKH26) 11. Начните с промывки культурный ЕРС дважды в бессывороточной среде. Внимание ограничить освещенности для защиты клеток во время и после маркировки. Обложка клетки с 4 мкМ PKH26 в Разбавитель С (раствор красителя) при комнатной температуре в течение 4 минут. Стоп маркировки реакцию добавлением свиной сыворотки в равном объеме с раствором красителя. Один мин позже, развести комбинированное решение 1:1 с полным средний рост. Аспирацию жидкости и промойте клетки х 3 с полной средний рост. Вымойте ЕРС дважды в DPBS (без CaCl 2, MgCl 2). Обложка клеток в трипсина и инкубировать при 37 ° С в течение 3 минут и подтвердите отряд под световым микроскопом. Добавить Трипсин нейтрализации раствора в двойном объеме трипсина используется. Комбинат ячейки решений в единую трубку и перемешать с помощью пипетки. Добавьте 10 мкл клеточного раствора в каждую сторону гемоцитометра для подсчета. Центрифуга клетка решение (1500 RPH, 5 мин.). Граф клетки и ресуспендируют гранул в 2 – 2,5 х 10 6 ЕРС / мл в сыворотке крови свободной среде. Обратите внимание, минимальный объем для заполнения трубки сборки составляет 4,5 мл. Разложите стерильную полотенце в биологических капот для стерильных области. Открытые газовые стерилизовать Ti сборки труб и дополнительные 5 см шприц на стерильную области. С стерильные перчатки, снимите поршень от 5 мл шприц и держать на поле для дальнейшего использования. Прикрепите Луер шапка на этот шприц. Внесите 4,5 – 5 мл EPC подвески под 4,9 в открытую бочку шприц. Вставьте поршень надежно обратно в открытый конец шприца. Держите шприц с цоколем вверх и снимите крышку. Вставьте шприц Луер концу первого в открытые трубки силиконовые собраний трубка Ti до уютно, не переходят в трубку Ti. Advance поршень шприца медленно, пока клетка решение достигает верхнего среза шприц "головной убор", удаляя пузырьки из системы. Закрыть крышкой с Луер и вставьте всю сборку в стерильные оболочки, герметизации открытого конца с лентой. Вставьте этот диск в сборе с держателем обрабатываемых в шприц 3.7. Место в инкубаторе при температуре 37 ° С и отрегулировать платформы так, чтобы часть трубки Ti посева камера уровне, с использованием воды датчик уровня (рис. 6). Разрешить Ti трубкой, чтобы повернуть за 30 минут до имплантации. 5. Имплантация Ti трубку в свиной нижней полой вены Двадцать четыре часа до операции, premedicate свинья (из которого было выделено ЕРС) с Фентанил патч (100 мкг / ч трансдермального; сохранить патч на месте х 72 часов). Держите свинья НПО в ночное время и администрировать Baytril (Энрофлоксацин) до операции в день операции (5 мг / кг, IM) и в течение 7 дней со дня, каждые 24 часов, как профилактика антибиотиками. Седативный, интубация и обезболить свиньи, как описано в разделе 1.3 (дыхательный объем на 10 -15 мл / кг) и закрепите кота в лежачем положении на операционной стол. Монитор свиньи во время процедуры путем измерения насыщения крови кислородом, частоты сердечных сокращений и температуры. Поддерживать терморегуляции с помощью автоматизированной подогревом операционный стол и отопления одеялом и при нагревании придают жидкости. Вставьте 18 G IV катетер в вену уха свиньи и защищать глаза свиньи с каплями Vetropolycin глаз. Чистый, приготовительные и драп живота свиньи, как в 1.6. Надрезать средней линии с # 15 лезвие скальпеля из второго набора молочных желез краниально до 2-го по последний набор каудально. Carry вскрытия до брюшной фасции с электрокоагуляции. Поднимите брюшины с Mosquito щипцами и осторожно ввести его с Metzenbaum ножницами. Externalize мочевого пузыря и место 3-О Викрил кисетный шва в стенку мочевого пузыря. Место удара разрез в ее середине и вставьте 16 F катетер Фолея. Администрирование внутривенное введение жидкости (лактат Рингера) для титрования на диурез> / = 1 мл / кг / час во время операции. После, экстернализации малого и толстого кишечника и место Бальфура два хирургических преднатяжителями подвергать задней поверхности брюшной полости и выявить нижней полой вены (НПВ). Использование острые и тупые рассечение, тщательно бесплатный IVC от окружающих тканей и скелетируют судно с правой почечной артерии проксимальнее бифуркации IVC дистальной. Упражнение крайне осторожно во время вскрытия IVC так как даже очень маленький дефект IVC может привести к быстрому кровоизлияния и обескровливание животного. Перевязывать все стороны ветвями сегменте IVC, чтобы не будет кровотечение вокруг трубки Ti для имплантации. Обратите внимание, обычно больших двух задних поясничной вены, которые требуют очень осторожны, вскрытие и труб. Кроме того, обратите внимание, что сразу проксимальнее бифуркации IVC, большой поясничной вены часто встречающихся на задне стороне и должны быть свободными и расчлененный управляться с судном петель в подготовке к зажим размещения. Приступить к посевной трубки Ti одновременно, как указано в 4. Администрирование 100 USP / кг гепарина непосредственно перед зажима IVC. Место под углом 45 градусов хирургические зажимы дистально на IVC и поясничной вены, а затем проксимально. Создать продольной veinotomy (4 см) между проксимальной и дистальной зажимы использованием # 11 лезвие скальпеля следует расширение с Поттс ножницами. Эвакуация любых кровь из IVC и промойте его внутреннюю полость стерильным DPBS. Теперь вставьте EPC-посеян Ti трубку (или голой контроль металла) в IVC и залейте его DPBS (с CaCl 2, MgCl 2) для предотвращения клетки от высыхания и эвакуировать воздух. Закрыть veinotomy с 4-0 Prolene швом и удалить одну проксимальных зажим для де-воздух IVC через небольшое количество резервного кровотечение. Место пребывания-шов "через стенку вены в трубы из ПВХ для предотвращения миграции имплантата с течением времени. Закрыть панель с O-ПДС на иглу КТ и подкожного пространства с 2-O Викрил (бег швов). Закрыть кожи с помощью скоб. Администрирование до 20 мл 0,25% Marcaine (Бупивакаин) подкожно вдоль разреза и покрывают рану марлей и Tegaderm. Также дайте Flunixin (2,2 мг / кг Q 24 ч) и оксиморфон (0,15 мг / кг, Q 3 – 4 ч) подкожно, сколько необходимо для боли. Прекратите анестезии, мониторинг свинья, пока проснуться и вернуться в клетку. Монитор свинью два раза в день в течение признаки бедствия / боль, стоя и ходьбе, кала и мочи, и цвет кожи указывает нормальное перфузии. 6. Эксплантации Ti трубки Через 3 недели, степенный, интубация и обезболить свиньи, как описано в 1.3 – 1.4. Приступить к лапаротомии, как описано в 5.5 – 5.8. Обратите внимание, что рубцы будут скрывать имплантата сайт, но вы можете прощупать жесткой трубки Ti на месте. Рассеките из IVC, как описано в 5.9 – 5.11 и эксплантов трубки Ti ан-блока с окружающими IVC с тяжелыми ножницами. Усыпить животное с Euthasol эвтаназии раствора (390 мг / мл, фенобарбитала натрия и 50 мг / мл фенитоин натрия на 1 мл / 10 кг). 7. Фиксация и визуализации внутренней поверхности Ti Промыть вырезали вены сегмента с трубкой Ti в растворе DPBS и сфотографировать его просвета (патент или окклюзия) с высоким разрешением цифровой камерой (рис. 7). После, исправить образца путем погружения в 3,7% параформальдегида в течение минимум 15 минут. Полоскание в растворе образца DPBS. Очень осторожно надрезать окружающие вены и ПВХ трубы, чтобы открыть трубку Ti. Место 3 секции под флуоресцентным микроскопом с внутренних поверхностей перед цель / источник света и образ при длине волны 550 нм возбуждения визуализировать PKH26 меченных ЕРС в красный / оранжевый цвет (рис. 8А). При желании, клетки могут быть дополнительно окрашенный (например, тромбоцитов эндотелиальных маркеров клеточной адгезии (PECAM)-пятном для визуализации границ ячеек (рис. 8Б), DAPI-пятном для визуализации ядер и т. д.). 8. Представитель результаты: После выполнения этого протокола, врачи и ученые могут endothelialize твердые структуры трубки с аутологичной крови полученных эндотелиальных клеток-предшественников в модель большого животного. Рисунок 2 показывает, что ЕРС изолированы с помощью нашего метода выглядят как колонии с булыжником морфологии приблизительно через 7 дней культуры. Наши посева Устройство, изображенное на рисунках 5 и 6 позволяет медленное вращение трубы Ti заполнены EPC подвески и приводит к равномерное покрытие внутренней поверхности трубки в стерильных условиях 9. Наши операции имплантации позволяет испытывать склонность биоматериалов, таких как Ti, развития тромбоза в модель большого животного. Мы обнаружили, что свиньи переносят эту процедуру, и что это имплантация может быть достигнуто только с минимальной потерей крови и без нарушения слоя EPC. т "> Рисунок 7 показывает, что голые трубки Ti полностью закрывает, тогда как наш EPC картонных трубки остается патент даже в условиях низких протромботическое сдвиг нижней полой вены. Кроме того, наличие вырожденных слоя флуоресцентно-меченых клеток подтверждает Успех этого метода, как показано на рисунке 8. Рисунок 1. Схема аутологичных эндотелиальных клеток-предшественников (EPC) посева эксперимента. Во-первых, периферическая кровь берется из свиньи. Далее, ЕРС изолированы от крови и расширена в культуре. ЕРС затем используются для линии титана (Ti) трубки устройства, который затем имплантируется в нижней полой вены одного и того же свинья, из которого клетки были изолированы. Рисунок 2. Представитель колонии ЕРС в области культуры, около 7 дней после изоляции процедуры (полученную с перевернутой Leica DMIL микроскоп с изображениями камеры и QCapture программного обеспечения). Рисунок 3. Ti трубки разделы перед сборкой. Ti трубки разрезают на три равные секции продольно, а затем сократить до 4,5 см длиной. Внутренние поверхности раздела Ti полируются использованием дробилки скамьи и наждачной бумагой, чтобы удалить видимые ямы. Рисунок 4. Ассамблея разделов Ti трубки ПВХ термоусадочные трубки (синий) и тепловые пушки. Ti разделы поддерживаются на обрабатываемой алюминиевой оправки, которая проходит через разделы Ti и соответствует размерам трубка Ti внутреннего диаметра. Рисунок 5 Титан трубкой, с указанием всех компонентов:. Луер шапка, "головной убор", шприц силиконовые трубки, и Ti трубки ПВХ обертывание (синий). Ассамблея вместе взятые перед стерилизацией для хирургического использования. Рисунок 6. Ti трубки посева установки внутри инкубатора, показывая двигателя, платформы, механически обработанные алюминий шприц держатель, Ti трубкой и 5 мл шприца. Примечание: Ассамблея показана без защитной оболочки стерильные для визуализации целей. Рисунок 7. Представителю валового результатов имплантации хирургии. () End вида контроля голой металлической трубки Ti после имплантации в свиной нижней полой вены (НПВ). Труба просвет полностью окклюзии с твердым сгусток. (В) Конечные зрения EPC-посеян трубки Ti после имплантации. Труба просвет полностью патент и ясно. (С) расчлененный зрения контроля (голый) Ti трубку после 3 дня имплантации, показывающие степень тромбоза (эксперименты проводились до 3-х недель продолжительности с одинаковыми результатами). Рисунок 8. ЕРС на поверхности трубки Ti следующие 3 дня имплантации (полученную с вертикально Leica DMRB микроскоп с QImaging QICAM монохромный цифровой камерой и изображение Pro Plus программного обеспечения). (А) Сливной клеток на поверхности показывает PKH26 перед операцией маркировки. (B) Сливной слой ЕРС. Красный: PKH26 перед операцией маркировки. Зеленый: EPC-PECAM пятно.