의식 억제 마우스에 인슈린 과다 - euglycemic 클램프

1. 샘플링 액세스 카테터와 마우스 안테나의 준비 (마사 TM) 그림 1A에 나타난 silastic 튜브의 6cm의 조각 (0.012 인치 내경)에 PE – 10의 1.3 cm의 조각 (0.011 인치 내경)를 삽입하여 동맥 카테 테르를 준비합니다. 메스와 PE – 10의 팁 베벨의 팁에 silastic의 끝에서 길이는 0.9 cm가되도록 베벨. silastic 관의 1mm의 조각 (0.020 인치 내경)와 같은 그림 1B에 표시된 silastic 튜브 (0.012 인치 내경)의 6cm의 한 조각 beveled 끝에서 1.1 cm를 슬라이딩하여 정맥 카테터를 준비합니다. silastic의 1mm의 작품은 금지 구슬로 사용됩니다. 마사 TM를 준비하려면, PE – 20의 두 3cm의 조각 (0.015 인치 내경)의 각으로 25 게이지 스테인레스 스틸 커넥터의 두 1.3 cm 조각을 각각 삽입합니다. silastic의 5mm 기사를 슬라이딩하여 서로 PE-20/connectors을 확보철강 튜브와 PE – 20이 만나는 지역에 튜브 (0.040 인치 내경). ~ 120 ° 각도로 강철 튜브를 구부와 ~ 45 ° 각 튜브를 분리합니다. 장소는 의료 실리콘 접착제의 덩어리에 장비를 완성 등 PE – 20 튜브는 수직이고 스테인레스 스틸 튜브의 끝부분이 접착제 (그림 1C) 넘어 확장되는. 이 24 시간을 설정하도록 허용합니다. 2. 외과 catheterization 수술하기 전에, 70 % 에탄올로 카테터를 소독, heparinized 식염수에 그들을 채우기 (200 U 헤파린 / ML 식염수) 및 스테인레스 스틸 플러그를 삽입합니다. 가급적 지속적으로 (예 : 흡입 isoflurane) 마취제를 제공하는 방법을 사용하여, 마우스를 마취. 무균 기술을 사용, 가위 및 / 또는 depilatory 크림을 사용하여 절개 사이트에서 머리를 제거하고 betadine 스크럽 다음 알코올로 피부를 소독. 카테 테르 삽입의 경우에 머리카락을 제거지역 아래턱에서 갈빗대의 상단과 쇄골 사이에 연장. 머리 뒤에 카테터의 externalization 들어, 두개골의 기지와 interscapular 지역 사이의 영역에서 머리를 제거하고 betadine 스크럽 다음 알코올로 피부를 소독. 온난 표면의 뒷면과 수술 현미경의보기 영역에서 마우스를 놓는다. 수술 테이프와 꼬리와 사지를 고정합니다. 마취를 전달 코 콘의 머리를 고정합니다. 흉골에 두부 작은 수직 중간선 절개 5mm하십시오. 집게를 사용하여 왼쪽 sternomastoid 근육을 노출하기 위해 조직을 해부하다 무딘. 왼쪽 경동맥을 노출이 근육을 반영합니다. 부드럽게 동맥의 결합 조직을 애타게. 이것은 동맥이나 신경 중 하나를 손상하지 않고 동맥에서 미주 신경을 분리하기 위해이 시점에서 중요합니다. 동맥을 분리하고 실크 봉합사로 두개의 끝부분을 ligate. 대충 매듭 다른노출된 선박의 꼬리 끝에 치료의 조각. 꼬리 끝에 마이크로 serrefine 클램프와 혈관을 고정하고 봄 가위로 출혈도 잡았 끝을 아래 했네요. 조심스럽게까지 클램프로 카테 테르를 삽입합니다. 조심스럽게 마이크로 serrefine 클램프를 풀어 silastic – PE의 접합에 카테 테르를 사전에. 카테 테르 안전하게 모두 ligatures를 묶어하고 확인하는 샘플링 주사기에 카테터의 무료 끝을 연결하여 카테 테르 샘플. 다른 절개 중간선의 오른쪽에 5mm과 첫 절개에 꼬리 약 2 mm하십시오. 집게를 사용하여, 오른쪽 경정맥 정맥을 노출하고 분리 조직을 해부하다 무딘. 조심스럽게 실크 봉합사로 두개의 끝부분을 ligate하고 느슨하게 꼬리 끝에 봉합의 다른 부분을 묶어. 단지 스프링 가위로 두부 묶인 아래 잘라 억제 비드에 카테 테르를 삽입합니다. 비드 뒤에 봉합을 묶어 및 카테 테르 샘플 그것을 확인합니다. 화RN은 마우스 이상 양어깨 사이로 작은 절개를합니다. 뒷면에있는 interscapular 절개에 대한 마우스의 전면에있는 동맥 카테 테르에 대한 절개의 피부 아래에 터널은 14 게이지 바늘,. 마우스의 뒷면에 그것을 외면 화하다하기 위해 바늘을 통해 동맥 카테 테르를 실. 뒷면에있는 interscapular 절개로 전면에 절개 사이트에서 마우스의 오른쪽에있는 피부 아래에있는 14 게이지 바늘을 터널링하여 경정맥 정맥 카테터에 대해이 단계를 반복합니다. 양어깨 사이로 절개 사이트에서 마이크로 serrefine 클램프와 동맥 카테 테르를 고정. ~ 1cm이 클램프 위 카테 테르를 잘라. 마우스의 머리쪽으로 향하게 스테인리스 스틸 커넥터와 마사 TM를 놓습니다. 마우스의 왼쪽을 향해 뾰족한 스테인리스 커넥터에 동맥 카테 테르를 연결합니다. 카테 테르에 구멍이나 단점을 보완하기이 없습니다 않도록 조심해. , 정맥 카테 테르에 대한 반복마우스의 오른쪽을 가리키는 스테인리스 커넥터에 연결. 양어깨 사이로 절개로 마사 TM를 삽입합니다. 경정맥 정맥 카테터에 해당하는 PE – 20 튜브가 왼쪽으로되어야 마우스의 오른쪽과 동맥 카테 테르에 해당하는 PE – 20 튜브하는 것입니다. 나일론 봉합사로 복부와 지느러미 incisions를 닫습니다. 지느러미 폐쇄, 봉합은 자리에 그것을 확보하기 위해 마사 TM의 강화된 실리콘을 통해 실행할 수 있습니다. 감염의 위험을 최소화하기 위해 heparinized 식염수와 항생제를 포함하는 꼴이지 솔루션을 사용하여 카테터의 명백을 확인합니다. 즉각적인 복구를 위해 따뜻해지 깨끗한 케이지에 넣어 마우스. 그림 2는 완성된 제품을 보여줍니다. 최소한 5 일 복구 마우스를 허용합니다. 무게 및 전반적인 건강을 모니터링합니다. 기관의 동물 관리의 승인으로 해당 게시물 수술 진통제 처방을 활용하고위원회를 사용합니다. 3. 인슈린 과다 – euglycemic 클램프 5 – 6h에 대한 빠른 마우스. 참고로, 시간 t = 0 분, 빠른의 마지막과 인슐린과 포도당 주입 (즉, 클램프 기간)의 시작을 나타냅니다. 일반적인 실험에 대한 설정과 시간 라인은 그림 3에 표시됩니다. 주입 및 샘플링 라인에 대한 마이크로 Renathane 또는 동급 튜브를 사용하십시오. 마우스를 위에 듀얼 채널 회전을 일시 중지합니다. 이것은 마우스 및 주입 / 샘플링 주사기 간의 허브 역할을합니다. 실험을 진행하는 동안 마우스는 가정 케이지 또는 이와 유사한 용기에 남아 스위블에 곁에 있습니다. 전에 마우스를 연결, heparinized 식염수에 동맥 샘플링 라인을 기입 (10 U 헤파린 / ML 식염수) 및 라인의 하단 끝에 스테인리스 스틸 커넥터를 놓습니다. 샘플링 라인의 상단에 연결된 heparinized 염분 (삭제 주사기)로 주사기를 남겨주세요. 이것은 혈액 samp을 작성하는 데 사용됩니다레. 스위블의 주입 포트 (세그먼트 그림 3A의) 라인의 맨 아래에있는 모든 방법부터 비 heparinized 식염수로 정맥 주입 라인을 채웁니다. 라인의 맨 끝을 플러그 앤 라인의 하단 끝에 (bolus이 시행되는 경우 또는 Y – 커넥터) 스테인레스 스틸 커넥터를 놓습니다. isotopic 포도당 추적기가 (예 : [3-3 H] 포도당) 경우 주입되고, 주입 주사기에 추적기를 포함한 1 ML의 주사기를 확보. 염분의 추적기 대신 (그림 3B)로 정맥 주입 라인을 채웁니다. 빠른에 3 시간, 마우스의 무게를 각각, 경정맥 정맥과 주입 및 샘플링 라인 동맥 카테터를위한 PE – 20를 연결합니다. [3-3 H] 관리하면 포도당 추적기, T에서 준비하는 연속 추적 주입을 시작 = -90 분 (그림 3C). 전형적인 마중물 선량은 1 μCi입니다. 포도당 솔루션을 – 0.05 μCi / μl [3 H 3] 준비비 heparinized 염분의 N. 1 ML의 주사기에 솔루션을로드하고 주입 펌프에 주사기를 확보. 20 μl / 1 분 분을 일으키는 마중물 복용을 관리할 수 있습니다. 90 분 평균 기간 0.05 μCi / 분 (1 μl / 분)의 지속적인 주입과 함께하십시오. 인슐린과 포도당의 infusates를 준비합니다. 인슐린은 캐리어 (BSA의 적절한 농도도 사용할 수 있습니다)와 같은 3 % 플라즈마를 포함하는 비 heparinized 식염수에 준비가되어 있습니다. 포도당 infusates은 농도 (5, 20 및 50 %)의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 가급적 실험 마우스 같은 변형 배경, 기증자 마우스 전체 혈액을 얻어 식염수 – 세탁 erythorocyte infusate를 준비합니다. 전체 혈액의 일반적으로 한 ML은 공부 마우스마다 필요합니다. 별도의 적혈구 혈액을 원심 분리기. 10 U / ML heparinized 식염수에 적혈구를 세척 식염수를 폐기하기 위해 원심 분리기. 적혈구의 볼륨을 결정, 10 U / ML hepari의 동일한 볼륨에 resuspend염분 nized. 1 ML 주사기로 각 infusate를 그려 및 개별 주입 펌프 각 주사기를 확보. 4 방향 커넥터 (그림 3) 각 주사기를 연결합니다. t에서 = -15 분 천천히 정산 주사기로 혈액 50-100 μl를 그림으로써 혈액 샘플을 채취한다. 동맥 샘플링 라인을 클램프 및 정산 주사기를 제거합니다. 휴대용 혈당 측정기를 사용하여 동맥 샘플링 라인의 클램프를 제거하고 혈액 포도당 미터 스트립 흘러함으로써 혈당 읽기 가져가라. 포도당 측정이 촬영되면, 동맥 샘플링 라인을 클램프 및 동맥 샘플링 라인에 야기한 바늘 주사기 (샘플링 주사기)를 삽입합니다. 클램프를 제거하고 샘플링 주사기로 혈액의 볼륨을 (주 참조) 그립니다. 동맥 샘플링 라인을 클램프와 샘플링 주사기를 제거합니다. 동맥 샘플링 라인으로 다시 정산 주사기를 삽입합니다. 모든 공기 방울을 제거하고 다시 달이다로 플런저에 그리기원래 부른 혈액 50-100 μl. 참고 : 샘플 혈액 볼륨이 수행되는 분석에 따라 달라집니다. 예를 들어, [3-3 H]의 분석 포도당 농도가 플라즈마의 10 μl을 필요로하므로 혈액의 50 μl가 그려져 있습니다. 이것은 필요한 경우 분석 플러스 추가 플라즈마에 대한 충분 플라즈마의 20-30 μl를 산출. 호르몬 및 기타 metabolites (예 : 인슐린, 무료 지방산)의 측정은 추가 혈액 샘플을 필요로합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 코팅 microtube에 샘플링 주사기에 혈액을 분배. 원심 분리기와 플라즈마를 수집합니다. -20 ° C.에 유학이나 즉시 매장의 말까지 얼음에 플라즈마를 유지 반복 T = -5 분 3.12로 3.10 단계를 반복합니다. 기준 플라즈마 인슐린 수준의 측정을위한 추가 혈액 (50 μl)를 구합니다. 헤파린 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 처리 모세관에 혈액을 그림으로써 기준 혈소판 측정. 측정 프랜 취득톰 플라즈마 샘플 T = -15과 -5 분은 기준 (예 : 금식) 값을 나타냅니다. T = -5 분 샘플 후, 4 방향 커넥터에 포도당, 인슐린 및 식염수를 입힌 적혈구에 대한 주입 라인을 입력합니다. 그림 3에 표시된 – 스위블 주입 포트 (포도당 또는 [3 H 3]을 일으키는 경우 튜브는 Y – 커넥터에 연결되어 있음)에 부착된 튜브에 4 방향 커넥터를 연결합니다. 먼저 생리를 입힌 적혈구를 일으키는 시작합니다. (혈액 500 μl 총이 연구의 120 분 이상의 샘플하는 경우 예를 들어, 4.2 μl / 분 주입 속도를 설정) 연구 기간 동안 샘플되는 혈액의 전체 볼륨을 교체하기 위해 주입의 속도를 설정합니다. 다른 infusates 대조적으로, 적혈구 솔루션은 빨간색입니다. 이 솔루션을 일으키는 것은 첫째 식별하고 수정해야 주입 라인에 잠재적인 저항이나 장애물을 허용합니다. 적혈구 infusate가 마우스를 도달되면 인슐린을 시작하고포도당 시달렸다. 이것은 현재 t = 0 분입니다. 인슐린은 상수, 미리 정해진 비율로 들어갈 수 있습니다. 사 무 인슐린 주입 속도 • kg -1 • 분 -1은 일반적으로 80~100%하여 내생 포도당 생산을 억제 후 2-3 배에 의해 포도당의 실종을 자극합니다. 초기 포도당 주입 속도 (GIR)이 기준 혈당 수준과 이전 경험을 바탕으로 추정된다. [3-3 H] 일으키는 경우에는 포도당을 한 포도당 매출의 예상 증가 (일반적으로 2-3 배 증가)과 일치하도록 추적 주입 속도를 증가하도록 선택할 수 있습니다. 마우스의 포도당 매출의 높은 비율을 고려, 혈액 샘플은 실험 기간 동안 포도당 농도의 측정을 위해 매 10 분 이상 이하도 동맥 라인에서 얻을 수 있습니다. 대상 euglycemia (그림 3C)을 달성하고 유지하기 위해 GIR을 조정합니다. 이 목표는 모델 또는 연구의 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 좋은 목표 GLucose 농도가 150 MG • DL – 1이 차우 – 공급 C57Bl/6J 마우스에 대한 전형적인 6h 금식 포도당 수준이기 때문이다. 목표는 이상적으로 최초로 40-50 분 이내에 신속하게 euglycemia를 달성하고, 정상 상태 기간 (T = 80 분)의 시작 부분에 의해 포도당과 GIR의 안정을 가지고하는 것입니다. [3-3 H] 일으키는 경우에는 포도당을, T = 80, 90, 100, 110 및 플라즈마의 측정 120 분 추가 혈액을 얻으 [3-3 H] 포도당 구체적인 활동. 추가 T = 100 혈액 및 플라즈마 인슐린의 측정 및 다른 호르몬 (S) 또는 대사 (S) 120 분를 수집합니다. T = 110 분, 클램프 혈소판의 측정을위한 헤파린 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 처리 모세관에 혈액을 그립니다. t에서 샘플 후 = 120 분가 함락되는 2 [14 C] deoxyglucose은 조직 고유의 포도당 이해의 측정을 위해 시행하실 수 있습니다. 경정맥 샘플링 라인에 연결된 bolus 라인에 12 μCi의 bolus를 관리합니다 (그림 3B </strong>). t = 2, 15, 25, 플라즈마 2 [14 C] deoxyglucose 수준의 측정 bolus의 관리 후 35 분에서 동맥 샘플링 라인의 혈액 샘플 (50 μl)를 구합니다. 마지막 샘플 이후, 동맥 라인에 직접 주어진 pentobarbital의 주입으로 마우스를 마취. 빠르게 포도당 이해의 평가 (다양한 형태, 지방 조직, 심장, 뇌 등 골격 근육)과 다른 조직 (예 : 간, 비장, 신장)에 필요한 조직을 해부하다. -80에서 액체 질소와 상점에서 냉동 조직을 스냅 분석 ° C까지. 조직 포도당이 phosphorylated 2의 축적을 측정하여 분석입니다 [14 C] 냉동 조직에 deoxyglucose 및 플라즈마에서 2 [14 C] deoxyglucose의 실종. 4. 대표 결과 인슐린 클램프 실험에서 얻은 결과의 예제는 그림 4에 표시됩니다.이 예제는 마우스의 촉진의 인슐린 저항에 높은 지방 다이어트의 능력을 보여줍니다. 혈당의 시간 코스, GIR 및 플라즈마 인슐린 수준 (기준 및 클램프)의 시간 코스 : 인슐린 클램프 결과의 모든 프레 젠 테이션이 interpretable 될 다음을 포함해야합니다. 마찬가지로 여기에 표시된 공복 혈당 (그림 4A)과 인슐린 (그림 4C) 수준은 인슐린 저항을 나타내는 높은 지방 다이어트를 먹은 마우스에 이상이 있습니다. 클램프 연구를 통해 포도당 수준 (그림 4A)의 시간 코스를 제시하면 독자가 클램프의 품질을 나타내는되는, euglycemia가 유지 얼마나 잘 평가할 수 있습니다. 마찬가지로, GIR (그림 4B)의 시간 과정은 독자가 정상 상태가 달성 얼마나 빠르게 확인할 수 있습니다. 시간 코스 2 시간 실험을 제시의 마우스 인슐린 클램프 문학에서 종래의 관행보다 훨씬 더 유익합니다 이러한 데이터를보기정의되지 않은 "클램프"기간 (4-13)에서 평균 값을 나타내는 하나의 기준점으로. 현재 예제에서는, 포도당 수치가 제어와 높은 지방 공급 단체 간의 테스트 조건이 동일했으나 GIR이 높은 지방 공급 그룹 (그림 4B)에 크게 낮은되었습니다. 이것은 전체 – 몸 인슐린 작용에 장해 나타내는 것입니다. 클램프 인슐린 수준은 더욱 이러한 생쥐에서 인슐린 저항 표현형의 존재를 지원, 높은 지방 공급 그룹 (그림 4C)도 높은되었다. isotopic 추적 혼합의 사용은 특정 조직에서 인슐린 작용의 평가를 위해 수 있습니다. [3-3 H] 포도당은 간장의 포도당 생산 (HGP)과 전체 – 바디 포도당 실종 (RD)의 속도의 인덱스이다 내생 포도당 모양 (고장)의 속도를 추정하는 데 사용됩니다. 인슐린 완전히 컨트롤 마우스의 HGP을 억제 반면에, 이것은 높은 지방 다이어트 (그림 4D)를 먹은 생쥐에 장애인입니다. 마찬가지로에의 능력컨트롤 마우스의 R & D를 자극하는 sulin가 높은 지방 다이어트 (그림 4E)를 먹은 생쥐에 손상됩니다. 2 [14 C] deoxyglucose는 포도당 신진 대사 지수 (RG), 조직 고유의 포도당 이해의 척도를 평가하는 데 사용됩니다. 마찬가지로이 예제에서 볼, 골격 근육에 인슐린을 자극 포도당 이해가 높은 지방 다이어트 (그림 4 층)를 먹은 생쥐에 장애인입니다. 그림 1 : 간선 (A)와 (B) 정맥 카테터와 (C) 마사 TM의 작성. 동맥 카테터는 0.012 "의 ID silastic의 6cm 기사에 3mm에 대한 PE – 10의 1.3 cm 기사를 삽입하여 준비가되어 있습니다. PE – 10 팁이 silastic로 베벨의 길이는 0.9 cm입니다 같은 beveled입니다. 정맥은 카테터는 아이디 silastic 0.020 "0.012의 6cm의 한 조각 beveled 끝에서 ID silastic 1.1 cm '의 작은 부분을 슬라이딩으로 만들어집니다. SE에 대한 접근 금지 구슬로 0.020"ID silastic 피스 행위는 경정맥 정맥에 카테 테르 치료. 마사 TM 두 개의 1.3 cm 각각의 조립을위한 25 게이지 커넥터는 PE – 20의 두 3cm 조각의 각에 삽입됩니다. 이들은 0.040 "의 ID silastic의 작은 조각으로 함께 개최됩니다. 커넥터가 120 ° 각도로 구부 러와 45 ° 각도로 구분됩니다. 온 회중이 의료 실리콘 접착제에 포장되어 있습니다. 그림 2 : Catheterized 마우스. 카테터는 수술로 왼쪽 경동맥과 오른쪽 경정맥 혈관에 이식하고 있습니다. 카테터의 무료 끝을은 머리 뒤에 externalized와 마사 TM에 연결되어 있습니다. 마사 TM은 양어깨 사이 subcutaneously 삽입됩니다. 이것은 마우스를 구속 처리 또는 마취 필요없이 인슐린 클램프 실험을하는 동안 혈관 액세스할 수 있습니다. JPG "/> 그림 3 : 인슐린 클램프 실험을위한 셋업 시간과 라인의 묘사. 마우스는 주입 및 샘플링 주사기를위한 허브 역할을 듀얼 채널 회전에 곁에 있습니다. 실험에 대한 일반적인 설정은 추적 혼합을 사용하여 (A)와 모두 사용하지 않는 [3 – 3 H] 포도당과 2 [14 C] deoxyglucose (B)이 표시됩니다. 설정 및 인슐린 클램프 (C)를 수행하기위한 절차의 시간 라인도 표시됩니다. 동안 클램프, 혈액 샘플 ( ) 혈당을 측정하는 매 10 분 촬영하고 있습니다. GIR은 euglycemia을 유지하기 위해 따라 조정됩니다. 기준 혈당, 혈장 인슐린, 그리고 플라즈마 [3-3 H]에 대한 샘플 포도당은 T = -15과 -5 분 촬영하고 있습니다. 클램프 플라즈마 [3-3 H]에 대한 샘플 포도당은 t = 80, 90, 100, 110 및 120에서, t = 100 및 120 분 클램프 인슐린에 대한 촬영하고 있습니다. 2 [14 C] deoxyglucose는 T = 120 분과 B에서 샘플 후 관리합니다lood는 t = 2, 15, 25, 후 35 분에 수집됩니다. 조직은 T = 35 분 샘플 후에 촬영됩니다. 그림 4 : 높은 지방 다이어트 (HFD)에서 마우스로 제어 다이어트 마우스 (차우)을 비교 인슐린 클램프 실험의 결과. 동맥 포도당 (A)와 GIR (B), 기준선 및 클램프 인슐린 (C), 고장 (D) 및 R & D (E)와 골격 근육 (gastrocnemius 및 vastus lateralis) RG (F)의 시간 코스는 표시됩니다. 모든 결과는 인슐린 저항을 유발하는 높은 지방 먹이의 효과를 나타냅니다.