表达GFP -肌动蛋白的内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架的研究

1。血管内皮细胞转染GFP -肌动蛋白有多种方法可用于转染的HUVEC。我们的实验室使用Nucleofector系统（龙沙，瑞士巴塞尔）概述如下。在一般情况下，迅速开展工作，提高细胞的活力和转染效率。每转需要5 × 10 5的血管内皮细胞，将接种到两个盖玻片（康宁1号，22 × 50毫米） 。 Nucleofector结合电击和化学试剂转染质粒DNA，通常达到的表达效率> 50％。化学转染试剂是一种替代方法。其中一组已成功转染GFP -肌动蛋白的牛内皮细胞，使用GenePORTER试剂6。 Nucleofector协议，我们使用如下所述。 可用于Presterilized cultureware或普通盖玻片，根据上腔型。盖玻片，在生物安全罩消毒它们放入一个10厘米的文化板含有约5毫升70％乙醇2分钟。接用无菌镊子和空气干燥，靠在一侧的一个单独的文化板块。 干燥后，放置在自己的10厘米的培养板的每个盖玻片。移取一个温暖的明胶溶液300μL盖玻片中心珠（0.9％氯化钠的1.5％）和允许站5分钟，然后吸。保持在这个矩阵涂层中心，而不触及的边缘，将确保将密集的种子细胞，并迅速将实现合流。 准备一个1.5 ml离心管，每转500μLEGM2MV媒体（龙沙），并设置在37℃，5％CO2培养箱预留。 用0.25％胰酶EDTA分离​​HUVEC和收集到15 mL锥形管。细胞计数。 5 × 10 5细胞需要为每个转。调整细胞悬液量，获得了颗粒将包含5 × 10 5乘以transfe数量细胞要执行的ctions。 在临床离心机在室温下3分钟的转速在5000离心细胞悬液。倾斜管吸上清液中删除尽可能多的媒体。 基本Nucleofector解决方案无论从血管内皮细胞或小学内皮细胞Nucleofector套件（龙沙）重悬沉淀。使用100μL每5 × 10 5细胞。由于此解决方案的毒性，重要的是迅速开展工作，而细胞悬浮在此解决方案。 GFP -β-肌动蛋白载体（0.2-2微克每100μLNucleofector悬挂）转染样品。 0.2-2微克每5 × 10 5％转染GFP -肌动蛋白的质粒DNA 。 100μL的细胞悬液转移到Nucleofector试管。封面和挖掘试管几次，以确保细胞悬液是一路的底部。 Nucleofector二的设备比色皿槽放入试管和运行的Desired电穿孔程序。我们使用的HUVEC方案A – 034。 返回试管的生物安全罩。从37℃的孵化器，其中包含500μLEGM2MV引擎盖离心管带来之一。在Nucleofector套件中所提供的传输移液器使用，轻轻地加入媒体的热烈500μL，在试管中的细胞悬液。所有试管背面的内容转移到离心管中，在孵化器15分钟。让细胞恢复。 重复步骤9-11，需要更多的细胞转染。 一个离心管中含有转染血管内皮细胞悬液600μL接种到两个盖玻片。引擎盖下，与1000μL微量，轻轻吸液管和一次混合悬浮液，然后直接放置到明胶涂层盖玻片300μL中止。不要让触摸悬挂在盖玻片边缘。在37 ° C / 5％CO 2的地点</sUB>孵化器为1-4 h，使细胞附着。 1-4 h后，检测转染细胞，以确认他们连接到盖玻片。再加入10毫升EGM2MV媒体，并返回到板37 ° C / 5％CO 2培养箱。 GFP -肌动蛋白的表达，通常可以观察4-8小时内。实验通常在24-48小时 2。设置的活细胞成像室和舞台加热器对于我们的研究来说，我们已经使用了华纳仪器开放钻石浴（RC22）放置在PH – 1阶段加热器，由重力流系统美联储。然而，有几个选项可用于活细胞成像的阶段，包括商会，容纳玻璃底培养皿，开放与封闭商会，以及各种microincubator /目标热水器组合和大型孵化器系统。最终，商会选择将取决于需要访问的浴中添加一个测试剂或药物等因素，WHE中期将静态或根据流量，和实验的长度。此外，有时温度不稳定等因素引起的焦点漂移，并能保持稳定的浴缸和客观温度控制系统，可以通过最小化。 分装足够的培养基实验。我们分装50毫升白蛋白的生理盐溶液（APSS;表1）为每个小时的实验将持续。 无论泵或重力流系统可用于提供中型会议厅。我们的系统中，我们添加了APSS从静脉流线，连接到一个内联加热器（华纳仪器型号为SH – 27A），内置一个简单的重力流系统。我们适用于流量约40毫升/小时。 如果将使用一个像我们这样的开放浴室，适用于真空润滑脂外缘钻石浴缸底面和一个棉签。下一步，我们得到一个细胞覆盖盖玻片从孵化器，并使用镊子轻轻抬起盖玻片。 GentlŸ触摸背面kimwipe吸收多余的介质，同时保持细胞覆盖的一面湿。随着细胞的脸，放在盖玻片钻石浴形成一个会议厅。 快速放置到舞台加热器室，并用手拧紧室夹具。在这一阶段的主要关注是，这些细胞会干出这种可能性。因此重要的是要迅速开展工作，并完成后，立即吸管 〜1毫升进入会议厅的介质，以防止细胞干燥。 我们的商会允许在细胞中期源源不断。只要打开流之前，重要的是附加一个真空软管，其持有上腔多余的培养基（APSS）出口许可证。内联热水器和浴霸，还应该打开此点（至37 ° C）。我们的系统也有一个热敏电阻探针来监测温度，应放置在浴缸的边缘。 仔细擦拭合作底面verslip与用70％乙醇浸泡去除剩余的EGM2MV媒体和盐建设一个kimwipe。干kimwipe或镜头纸擦拭第二次。 商会已成立后，流量，温度稳定在37℃，允许至少30分钟的细胞开始实验之前，调整和稳定。 在等待，打开所有的活细胞成像显微镜（灯，滤光轮控制器，相机，电脑）的组成部分。 3。收购活细胞成像显微镜数据各种活细胞显微镜系统。我们的制度是尼康的Eclipse TE – 2000U以下组件： 萨特仪器LAMBDA LS 300 W氙灯萨特仪器LAMBDA 10-3激励与SmartShutter和S492过滤器的过滤器轮（D350和S572励磁过滤器也可用于紫外线和RFP应用） 分色2002bs发射器（尼康61002米） CI计划Fluor公司10X DLL的目的，NA 0.30（尼康MRH10100） 福陆公司ELWD计划40X马克目的，不适用0.60（尼康MRH08420） 计划载脂蛋白VC 100X油目的，NA 1.40（尼康MRD01901） Photometrics CoolSNAP HQ2摄像头，1392 x 1040成像阵列，6.45 x 6.45微米像素 （罗伯科学） 我们也有两个软件，可用于图像采集的软件包。尼康元素AR 3.0和6.1 Metamorph。 查看细胞和找到一个适当的区域进行研究后，锁粗调旋钮，检查收购，使该软件设置： 滤光轮被设置为S492过滤器（标有“FITC”在我们的配置） 在采集软件，其目标是，以配合所需的放大倍率（非机动的，但我们的显微镜是这台微米/像素比）。还要确保optivar显微镜镜头设置为1.0倍放大倍率。设置的optivAR可能会增加至1.5x放大倍率，但在失去信号强度为代价。 要使用的放大倍率，取决于研究的目的。最好的细节，与高的数值孔径100X目标，将提供最好的空间分辨率和信号传输。我们的显微镜还配备了40X长工作距离不同的应用程序，需要额外的距离预期的目标。然而，这个目标可能是有用的，当我们想同时观察多个单元格，并且工作正常观看细胞器大小的结构，然而在失去了空间分辨率和信号强度的成本。对于任何研究中，信号强度是一个端点，或更多先进的成像技术，如荧光斑点显微镜，100X的客观建议。 相机的曝光时间是0.5-2秒之间这取决于在细胞GFP -肌动蛋白的强度。我们通常使用尽可能低的曝光时间，以避免“基本法”eaching的绿色荧光蛋白，肌动蛋白和细胞的潜在毒性。 为了达到最佳的决议，应设置分级1 × 1，增益为1。在某些情况下，我们已成立分级为2 × 2，以减少曝光时间，然而，这降低了精密的测量，我们可以使移动的物体在时间推移研究。 配置时间推移设置： 选择文件夹来保存拍摄的图像，然后键入一个文件名。 设置图像和实验的时间间隔持续时间。我们通常使用图像和持续时间长达2 h之间的15秒到1分钟的时间间隔。 确保主动快门设置为封闭之间的收购。 开始前的时间推移图像采集，关掉房间的灯和捕捉一个图像检查设置。 还可以捕获一个明形象。确保设置适当阶段或DIC过滤冷凝器。开启卤素灯和收集图像。关闭卤素灯。 恢复“FITC标记的”设置时间推移成像和测试图像捕捉。 捕获的时间推移系列。 在实验过程中，它是重要的监控图像，因为它们是收购。在某些情况下，在室内温度的微小变化可能会造成焦点漂移。这可避免通过优化流入和真空线，使流量稳定在细胞。此外，交通，最大限度地减少在显微镜室和重定向从天花板通风口的草稿，远离显微镜能有所帮助。一个曾在我们的经验以及另一种方法是使用37 ° C / 5％CO 2培养箱商会，包围整个舞台和客观。这些提供了监测细胞过夜或更长的优势，但进入细胞是有限的。 如果有必要，暂停收购时间推移和调整图像。执行的重新调整，尽快避免改变图像之间的时间间隔。 一个典型的协议将包括基线图像20-30分钟，然后加入一个额外的图像采集0.5至4小时的测试代理。实验的长度可以是有限的，随着时间的推移，这就是为什么它是重要的选择最短的曝光时间可能GFP的漂白。它也可能是可取的改变时间的推移图像之间的时间间隔为30-60小号，如果需要一个较长的研究。 4。数据分析几个软件包可以用来分析图像集，如NIS元素，Metamorph，Slidebook等，我们通常会执行我们的图像分析NIH ImageJ使任何计算机上对我们的实验室或在家分析。我们使用的版本是： 医疗保险基金ImageJ（ http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ ） 斐济（我“目标=”_blank“> http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji）。 ImageJ可以用来分析许多动态的过程，包括： lamellipodia突起的频率 的距离，时间，和速度的突起 随着时间的推移肌动蛋白纤维运动 尼康元素为“ND”文件保存时间推移图像。要打开在I​​mageJ需要转换为TIF系列使用“出口ND文件”功能。在ImageJ Metamorph图像栈可以打开，无需进行修改。我们选择开放ImageJ为TIF系列的一个选择，是要转换为8位灰度。这使得看的更轻松，因为亮度和对比度的调整将适用于整个系列，而不是被视为单一的形象。 ImageJ，图像设置打开时，片数/总片将显示在窗口的顶部左上角，连同文件名，像素，文件类型和大小。底部的Z滚动对应的时间。此外，指针悬停在图像上显示的X，Y和Z ImageJ工具栏的底部的像素位置。 Lamellipodia突可以研究通过确定新的突起，随着时间的推移。这是可以做到整个单元的周长或选定的区域。这种类型的分析，也可以nonconfluent，未转染细胞相衬或DIC显微镜。然而，使用GFP -肌动蛋白表达允许汇合单层分析，尤其是当缺乏GFP -肌动蛋白细胞含有彼此相邻。 Lamellipodia前伸距离，持久性（时间）和速度可以kymograph（行扫描）分析评估。画一条线垂直于细胞边缘（这是最简单的，如果没有相邻的单元格或相邻的细胞不表达绿色荧光蛋白，肌动蛋白）。 ImageJ，按“/”将生成一个kymograph，与X轴代表ðistance和y轴代表时间（15秒至1分钟每像素根据以上的时间间隔指引）。线可以得出，一个突出的lamellipodia和箱尺寸测量（按ImageJ中号）。然后可以计算距离，时间和速度。 应力纤维的运动，也可以由kymograph分析测定，以类似的方式。 5。代表性的成果： 在该地区的血管内皮细胞表达绿色荧光蛋白肌动蛋白> 90％，我们的转染协议，我们通常看到至少有50％的血管内皮细胞转染GFP -肌动蛋白的表达，往往可以找到盖玻片地区。一个subconfluent血管内皮细胞表达GFP -肌动蛋白的活细胞成像实验的一个例子是在电影1所示。对于这个特殊的实验中，图像被收购，每分钟一次。可以看到在电影中，GFP -肌动蛋白的血管内皮细胞，可以观察到整个细胞质中，以及在丝状结构URES，并在当地lamellipodia沿着小区边缘凸出。在影片中也明显的是，GFP -肌动蛋白表达细胞之间是不统一。研究选择的细胞通常有足够的GFP -肌动蛋白存在各种含有丝状肌动蛋白的结构形象化。细胞表达GFP -肌动蛋白非常高的水平，可以为研究问题，因为在这些细胞中，它通常是难以区分的G -肌动蛋白目前的高F -肌动蛋白的结构。 电影2显示融合血管内皮细胞表达GFP -肌动蛋白的行为的一个例子。 subconflent血管内皮细胞一样，积极lamellipodia沿周边的细胞的形成和营业额是明显的。但是，这些lamellipodia往往引起膜皱褶，说明效率较低突7。这可能是由于阻断附近的基质相邻细胞的存在。皮层肌动蛋白纤维和应力纤维也可以看到电影1和2。虽然我们Ø细胞bserved保持固定，应力纤维类似横弧纤维细胞迁移，细胞边缘附近形成，并朝着细胞中心， 他们拆解的 8， 9横向。在这些细胞中观察到的一个额外的动态特征是肌动蛋白环结构的形成，扩大同心，以前名为肌动蛋白云 10 。 设置使用kymograph分析的是图1所示的距离，持久性，细胞突起的速度是如何从这些时间推移图像量化的一个例子。图1a中，单个像素的界线大致垂直kymograph生成细胞（图1B）的边缘。在此kymograph，由该行定义的区域是垂直放置，从整个时间推移的图像水平堆放。从左至右kymograph右侧，突起在小区边缘向上运动的代表。图1C，一条线是SUPerimposed其中一个突起的边缘，并与该行相关的像素数据收集和结果“窗口中显示在面板的底部。这种分析可以量化突动态，也可以用来估计突频率（突起的数量/时间），在这个区域的细胞。 应力纤维的运动分析的一个例子是如图2所示。最看重的纤维，我们观察到细胞边缘附近形成，并走向细胞中心，在那里他们最终拆解。这也可以量化kymograph分析。绘制一条线垂直小区边缘的应力纤维（图2A）kymograph产生（图2B）。应力纤维的出现在胞质区在kymograph不断线，经常向下移动，并朝着细胞中心）的权利（。有时纤维是很难看到在原来的kymograph，并在这些情况下，我们使用USM锐化过滤器，锐化图像（图2C）。线画上的应力纤维和像素数据的收集使用的测量功能（图2D）。收集这些数据的另一种方法是从一开始就画线，完成确定的应力纤维，纤维（图2E），持续时间平均坡度。这种分析可以量化的应力纤维横向运动，也可以用来量化这个区域的细胞中观察到的应力纤维的数量。 图1。Kymograph小区边缘的分析，以确定前伸距离，持久性，和当地lamellipodia 速度 。单个像素的界线大致垂直边缘的细胞。这个地区从每个时间推移产生随着时间的推移地区的蒙太奇图像中提取， B。在日Ë产生kymograph，X轴代表时间，移动从左至右，Y轴显示的距离。随着时间的推移小区边缘的运动，可以在此kymograph评估，并lamellipodia确定小区边缘，移动向右，向上推移的地区，C。已确定由一个lamellipodium突细胞边缘上绘制一条线。绘制的线条的边界矩形的尺寸，然后收购（叠加窗口中显示）。宽度是用来计算突的时间或持续。高度用于计算前伸距离。突速度计算宽度除以高度。在这个例子中，向上的距离为96像素x 0.16125微米/像素= 15.5微米，时间为11像素× 1分钟= 11分钟/像素。计算速度为15.5μm/11分钟。 = 1.4微米/分。 Figure 2。Kymograph运动的肌动蛋白应力纤维分析。绘制单个像素线垂直边缘的细胞产生kymograph。 乙 。如图。 1，在kymograph，X轴代表时间和y轴的距离。应力纤维的观察往往会下降，连续线条，在细胞内的权利（箭头）C 。为了更好地可视化的应力纤维，USM锐化过滤器都可以使用。在这个例子中，半径3像素和面罩重量为0.60，D。单个像素的线，然后绘制确定的应力纤维，以及收集到的数据。在此面板中，三线绘制，然后“删除”被压在每次测量后，使一个永久的注释，它们的位置（ 白线） ，E。另外，如果需要的应力纤维的平均距离，时间和速度是，线可以得出的开始和结束点（黄线），和数据R的可收购（“结果”窗口中强调）。对于这个例子中，测量了这37帧的应力纤维的X 1帧/分钟。 = 37分钟。行驶距离超过这个时间段是75帧x 0.16125微米/像素= 12.1微米。由此产生的应力纤维的横向速度为12.1μm/37min= 0.33微米/分钟。一个积极的速度值是分配向细胞中心，并负向周边移动纤维的纤维。 电影1。延时居住的HUVEC表达GFP -肌动蛋白的图像。图像之间的时间间隔为1分钟。本地lamellipodia突出沿整个周边的细胞。此外，横弧应力纤维向细胞中心横向移动。当凝血酶（1 U / ml）的添加到洗澡，细胞收缩略有lamellipodia向外突起，约​​10分钟的暂停。细胞收缩后，lamellipodia形成和营业额恢复 D. 点击这里观看影片。 电影2。聚合血管内皮细胞表达GFP -肌动蛋白，凝血酶治疗前后。经过时间显示在右下角为分钟：秒。图像之间的时间间隔为30秒。凝血酶（1 U / ml）的加入后45分钟。基准期。附加说明的事件，包括当地的形成和成交量lamellipodia（细胞边缘附近的箭头，0:59 – 37:29），云肌​​动蛋白（箭头，1:59 – 21:29），和凝血酶添加后，在tricellular交界的差距扩大（箭头，62:30 – 70:00）。横向弧应力纤维也明显在几个细胞。细胞显示积极形成和当地lamellipodia的营业额沿其周边许多引起膜皱褶。凝血酶引起的暂停lamellipodia形成和营业额，并短暂露面的细胞之间的一些小差距。http://www.jove.com/files/ftp_upload/3187/Movie2-confluentHUVEC.avi“>点击这里观看影片。