Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Todas as soluções, meios de comunicação, instrumentos, filtros e tubos devem ser estéreis e manuseadas com técnica estéril para reduzir o risco de contaminação. Prepare todos os tampões e media 24 horas de antecedência e armazenar a 4 ° C. 1. Separação parenquimatosas e não parenquimatosas do fígado inteiro Prepare a solução de enzima para a digestão, utilizando um tubo cc 15 com tampa de rosca em PBS estéril 10 ml contendo 5 mg de colagenase, 5 pronase mg e 1 mg DNAse. Euthanize mouse usando instituição aprovado (Animal Care Institucional e Comitê Use) método de asfixia, como o CO 2. Limpe área abdominal dos animais sacrificados com solução de etanol 70%. Utilizando instrumentos estéreis, a cavidade abdominal aberta e fígado explante en-bloco. Remover vesícula biliar do fígado explantado. Transferência de fígado toda a capa de fluxo laminar no prato estéril fechado. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Usando uma lâmina estéril, mince fígado com a combinação de vários cortes horizontais e verticais por 1 minuto no prato estéril. Coloque ¼ de polpa picada do fígado em 15 tubos com 10 cc cc PBS com colagenase, pronase e DNAse a partir do passo 1.1 acima. Repita com cada fígado ¼ picada. Colocar os tubos com ¼ de celulose e enzimas do fígado picada em banho-maria a 37 ° C por 45 minutos, com agitador, 1-2 ciclos / segundo. Limpe os tubos com álcool 70% após a remoção do banho de água antes da transferência para a capela de fluxo laminar. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Tensão de celulose digerida fígado através de 70 mícron filtro de rede para coletar em um prato estéril. Usando alíquotas de 2 ml de DMEM estéril: F12 media com 10% de calor soro fetal bovino inativado, lavar o filtro e usar o final de borracha de um êmbolo da seringa para amasse a polpa digerida através do filtro. Repita 5 vezes para fazer volume total de filtrado cerca de 20 mL. Divide-se o filtrado em dois tubos de 15 mL igual. Todas as transferências devem ser concluídas em capela de fluxo laminar, e usar centrífuga refrigerada a 4 ° C, se disponível. Centrifugar a 50 xg por 1 minuto. Guarde o sobrenadante # 1 e descarte do parênquima pellet. Centrífuga sobrenadante # 1 a 50 xg por 1 minuto. Guarde o sobrenadante # 2 e descarte da pelota. Centrífuga sobrenadante # 2 a 50 xg por 1 minuto. Guarde o sobrenadante # 3 e descarte da pelota. Centrífuga sobrenadante final # 3 para 180 xg por 8 minutos para a obtenção não-parenquimatosa fração. 2. Lise de células vermelhas Trabalhar em capela de fluxo laminar, manter as células frio, e soluções de uso resfriado a 4 ° C. A noite antes do procedimento, prepare tampão de lise das células vermelhas, diluindo a concentração de ações 10X BD Pharm Lyse buffer com uma diluição de 1:10 com água destilada estéril. 1X solutionshould ser armazenadas por 30 dias a 4 ° C. A noite antes do procedimento, prepare Miltenyi buffer usando estéril PBS, 0,5% de soro albumina bovina, e 2mM EDTA. Solução de filtro com unidade de vácuo com filtro de 0,45 mícron filtro. Tampa superior da unidade tilter com tampa de plástico original e segura com filme plástico. Storeentire unidade de filtro a 4 ° C por 12 horas para degas EDTA. Unidade de filtro pode ser substituído com tampa estéril padrão após 12 horas. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Usando um tubo de 5 ml estéril, re-suspensão não-parenquimatosa pellet a partir do passo 1.6 em 1 mL de 1X tampão vermelho sangue diluído lise celular de 2.1 acima. Tampe o tubo de transferência para fora da capela de fluxo laminar. Suavemente vórtice para cinco segundo e incubar por 15 minutos a 4 ° C protegido da luz. Centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Descartar hemácias lisadas no sobrenadante e re-suspensão sedimento em 1 ml de tampão Miltenyi gelada e estéril. Centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Este procedimento é concluído em uma capela de fluxo laminar. Elimine o sobrenadante e re-suspensão sedimento em 1 ml de tampão Miltenyi gelada e estéril. Retire 10 ml de PBS suspensão celular e adicionar 10 ml tryan azul. Contar remainingnon-parenquimatosa células usando hemocitômetro. 3. CD45 a depleção de células hematopoiéticas de não-parenquimatosa fração Trabalhar em capela de fluxo laminar, manter as células frio, e soluções de uso resfriado a 4 ° C. Suspender as células em 100 mL de Miltenyi buffer por 107 células de até 108 células total. Aplicar 20 mL de anticorpos CD45 Miltenyi microbead para cada 107 células e incubar a 4 ° C por 15 minutos. Adicionar mais 2 ml de tampão Miltenyi e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Remover o sobrenadante. Re-suspender pellet celular (até 108 células total) em um buffer de Miltenyi ml. Na capela de fluxo laminar, as células do filtro com Miltenyi coluna LD magnético. Comece por colocar coluna em suporte magnético (Miltenyi MidiMACS ou QuadroMACS). Coloque o tubo ml estéril 5 abaixo filtro para pegar filtrado. Prepare coluna por carregar 2 ml Miltenyi buffer. Uma vez pré-filtro de lavagem é completa, células de carga em coluna LD. Uma vez que a suspensão celular está dentro da coluna, adicionar 1 ml de tampão e repetir Miltenyi 1 ml Miltenyi tampão de lavagem 2 vezes. Não use êmbolo fornecido com coluna para aumentar a velocidade de filtração. Apenas recolhemos filtrado quando o filtro de colocado no suporte magnético. Centrifugar o filtrado recolhido de cerca de 5 ml (a coluna tem o restante 1 ml) de CD45 com depleção de células não-parenquimatosas a 200 xg por 5 minutos. Descartar a coluna com o retido CD45 células positivas. 4. Isolamento citometria de fluxo de células CD133 positivo Prepare a mídia celular oval. Use 1:01 DMEM: F12 média com 10% de soro fetal bezerro inactivado pelo calor como base, e adicionar insulina (1 mg / ml), HEPES (5 mol / L) e penicilina / estreptomicina (1% volume / volume). Solução de filtro com unidade de vácuo com filtro de 0,45 mícron filtro. Re-suspender as células em tampão a 100 mL Miltenyi por 10 7 células. Adicione 2 mL de CD133-PE anticorpo conjugado. Usando um segundo grupo de células, incube com IgG-PE anticorpo conjugado como um controle. Manter um terceiro grupo de células sem coloração como um controle sem mácula para FACS. Incubar a 4 ° C por 15 minutos no escuro. Re-suspender, buffer de 2 ml coloração. Centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Elimine o sobrenadante e re-suspensão sedimento em 1 ml de buffer Miltenyi. Esta etapa é realizada usando o padrão de citometria de fluxo procedimentos de classificação de células, que podem ser específicos instituição. Usando células imaculada e células IgG PE manchado, ajustar parâmetros para classificação gating otimizada de população de células CD133 +. PE (R-Phytoerythrin) pode geralmente ser usado com qualquer citômetro de fluxo que tem um laser que emite a 488 nm. A emissão de pico para PE é 575 nm e é detectada no canal de FL-2. Nota: Usando uma BD FACS Calibur ou máquinas BD FACS Vantage, com o programa da Quest celular para coleta de dados, usamos Encaminhar Scatter e Side Scatter vista na escala log para identificar populações de células, com dispersão lateral definido para 250. FL1 e FL2 estão ambos em escala logarítmica e definido para 550. Estes parâmetros fornecem um lugar de partida inicial para ver o fígado não-parenquimatosa células, e são ajustadas conforme a necessidade com base na intensidade de coloração das populações positivos e negativos. Isolar a população de células CD133 + + utilizando CD133 portão e recolher as células em células estéreis media filtrada. 5. Cultura métodos celular FACS centrífuga coletadas células a 200 xg por 5 minutos. Re-suspender pellet celular na mídia célula oval, com cerca de 5.000 células por ml. Pode começar com concentrações mais elevadas, de até 50.000 células / ml para experimentos iniciais, e reduzir, melhora técnica e viabilidade celular global e melhora o rendimento. Células em placa de BD Biocoat laminina revestido 96 placas de bem com 1000 células / cm 2. Lugar em cultura de células incubadora umidificada a 37 ° C, com 5% de CO 2. Após 24 horas, adicione Fator de Crescimento de Hepatócito (50 ng / nl) e Fator de Crescimento Epidérmico (20 ng / ml). Para células individuais, isolar as células diretamente em 50 ul de mídia célula oval em cada poço de uma placa de 96 laminina bem revestido. Use FACS configurações única célula de rigorosa seleção de uma célula positivas. Após 24 horas, adicione 50 ul de mídia célula oval com HGF e EGF como acima no passo 5.2. Mudança de mídia totalmente após 5-7 dias. Uma vez que as colônias em expansão são superiores a 50% confluentes, que tipicamente ocorre após duas semanas, dependendo do número total de células viabilidade banhado e celular, as células podem ser divididos 01:03 como abaixo. Dividir células utilizando tripsina-EDTA 0,05%. Aplicar apenas o suficiente para cobrir bem fundo, 5-10 mL / poço em placa de 96 poços. Colocar em estufa a 37 ° C por 3-5 minutos. Adicionar 100 mL de mídia a cada poço e transferir todos os líquidos a 5 ml do tubo. Adicionar 1 mL de mídia a cada tubo e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Re-suspender as células em meios de prato em prato revestido laminina, usando células de um bem a placa em três novos poços (1:3). 6. Confirmação de bi-potencial status usando RT-PCR Este procedimento é detalhado no RNeasy protocolo manual, que é fornecido com o Kit RNeasy. Use RNeasy colunas micro por 96 colônias placa bem. Aspirar meios de cultura de cada poço. Adicionar 75 mL tampão RLT (de Kit RNeasy) diretamente a cada poço. Raspar a placa com fundo policial de borracha estéreis. Pipettelysate em micro-tubo de centrífuga e mistura vortex por 1 minuto. Adicionar álcool 70% para lisados ​​e misture por pipetagem. Transferir a solução para a coluna RNeasy colocado em um tubo de coleta de 2 ml (como fornecido no Kit RNeasy) e centrifugar em centrífuga de micro-por 15 segundos a 10.000 rpm. Descartar eluída filtrado. Re-utilizar o tubo de coleta. Adicionar 350 mL de buffer RW1 (Kit RNeasy) para a coluna RNeasy e centrifugar por 15 segundos a 10.000 rpm para lavar a colunamembrana. Descartar lavar eluídos. Adicionar 10 mL de solução stock DNase I para 70 mL de buffer RDD (ambos fornecidos no Kit RNeasy). Adicione o 80 mL DNase I Tampão mix de incubação RDD à membrana coluna RNeasy e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Adicionar 350 mL de buffer RW1 (kit RNeasy) para a coluna RNeasy e centrifugar por 15 segundos a 10.000 rpm para lavar a membrana. Descartar lavar eluído e tubo de coleta. Coloque a coluna RNeasy em um novo tubo de recolha de 2 ml (fornecido no kit RNeasy). Adicionar 500 mL de buffer RPE (Kit RNeasy) para a coluna RNeasy e centrifugar por 15 segundos a 10.000 rpm para lavar a membrana. Descartar lavar eluídos. Prepare etanol 80% usando RNase água (Kit RNeasy). Adicionar 500 mL de etanol 80% para a centrífuga columnand RNeasy por 2 minutos a 10.000 rpm. Descartar lavar eluídos. Coloque a coluna RNeasy em um novo tubo de recolha de 2 ml (Kit RNeasy) e centrifugar a toda a velocidade por 5 minutos. Descartar qualquer lavar eluído e tubo de coleta. Coloque a coluna RNeasy em um novo tubo de coleta de 1,5 ml (kit RNeasy). Adicionar 14 água RNase mL (Kit RNeasy) para o centro da membrana coluna e centrifugar por 1 minuto em velocidade máxima. Coletar filtrado com RNA purificado e transferência para a criação de cDNA de gelo se imediatamente ou loja a menos 80 ° C para uso futuro. Transcrição reversa utilizando um inibidor da RNase Omniscript.Dilute para uma concentração final de 10 unidades / mL na gelada 1x tampão RT. Vortex por 5 segundos, pulso e centrifugar por 5 segundos. Prepare uma mistura mestre fresco no gelo de acordo com a página 13 do Omniscript protocolo. Vortex por 5 segundos, pulso e centrifugar por 5 segundos. Recomendo para preparar um volume de Mastermix 10% maior do que o necessário para o total exigido para todas as reações. Adicionar RNA modelo para os tubos individuais contendo mix master. Vortex por 5 segundos, pulso e centrifugar por 5 segundos. Incubar por 60 min a 37 ° C. PCR amplificação de hepatócitos (albumina) e cholangiocyte genes específicos usando HotStarTaq DNA polimerase. Prepare mistura de reacção por página 15 do livro HotStarTaq protocolo. Recomendar ações para diluir primers concentração de 20 pm / mL, e com um tubo mL / reação primers usados ​​para frente e para trás. Dependendo do número de células inicialmente utilizado para a extração de RNA, recomenda-se dividindo cDNA final entre 3 tubos de reação (β-actina para o controle de carga, albumina e KRT19) para iniciar. PCR desenho de primers é listada na Tabela 1. Coloque os tubos de reação em termociclador. Recomendo seguinte programa para experimentos iniciais: 95 ° Cpara 15 minutos x 1 ciclo seguido de 95 ° C por 30 segundos, 55 ° C por 30 segundos, 72 ° C por 30 segundos x 35 ciclos, seguidos de 72 ° C por 10 minutos. Os produtos de PCR são analisados ​​usando brometo de etídio impregnada agarose gel. 7. Confirmação do potencial de tumor de células CD133 +-tronco Este procedimento pode ser feito com recém-células isoladas a partir do passo 4 ou uso de células que foram cultivadas a partir do passo 5. Recomendamos a realização de experimentos iniciais com células cultivadas, como as células recém-isoladas terão reduziu a viabilidade e produtividade reduzida. Trypsinize células utilizando tripsina-EDTA 0,05% a partir do passo 5.5 acima. Depois de 3-5 minutos de incubação a 37 ° C, adicionar 100 mL de mídia para cada bem e transferir todo o líquido de cada poço a cada 5 tubos de ml (1 tubo bem = 1). Adicionar 1 ml de mídia a cada tubo e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. Re-suspender as células em 1 ml de gelo frio PBS. Retire 10 ml de PBS suspensão celular e adicionar 10 ml azul de tripano. Usando trypan exclusão azul, determinar o número de células vivas. Se estiver usando FACS células isoladas, o número de células será determinado pela FACS contar isolamento. Células Centrifugar a 200 xg por 5 minutos e ressuspensas em PBS na concentração de 1 x 10 6 cells/100 mL ao vivo. Adicionar 100 mL Matrigel. De seis semanas de idade, imuno-deficientes camundongos Nude foram injetados com 28 agulha gague. Injectar 1 x 10 6 células em 200 mL por site. Ratos são monitorados para o crescimento do tumor diária. Uma vez que os tumores forma, geralmente após 3-4 semanas de incubação, o volume de tumor é medido com paquímetro (altura x comprimento x largura). 8. Resultados representativos: De normal, fígado saudável de camundongo, o rendimento esperado celular da CD133 + células-tronco do fígado é de 1.000 a 5.000 por fígado. Estas células são relativamente raros no fígado quiescente e não expandir também na cultura. Nós não recomendamos o uso de análise única célula no fígado normal e no rendimento de células viáveis ​​que irá expandir é extremamente baixo. Para fígados com lesão crônica significativos, tais como a dieta DDC 0,1% para 6 semanas 1 ou modificação genética, resultando em lesão crônica, tais como o MAT1a – / – ou PTEN específica do fígado – / – ratos, 2-4 o número esperado de celaumenta ls isolada, com até 100.000 células do fígado / isolada (Figura 2). Se utilizando modelos genéticos, o conhecimento da taxa de tumor espontâneo é crítica, uma vez que estes procedimentos para o isolamento de células-tronco do fígado deve ser realizado em animais livres de tumor. Por exemplo, se o MAT1a – / – modelos de formulários tumores espontâneos em 18 meses, recomendamos o uso de animais, o mais tardar 15-16 meses, antes de qualquer tumores relatados espontânea. Isolamento de células isoladas a partir de modelos lesão crônica trará várias (3-9 placa colonies/96 bem) colônias que se expandem a partir de células individuais, uma vez que o procedimento é dominado, e viabilidade das células é garantida. Figura 3 apresentam representante imagens de contraste de fase de colônias derivadas de um único CD133 + células expandidas após 7 dias. Confirmação do bi-estado em potencial é realizado usando albumina e Krt19 RT-PCR. Colônias de células expandidas única irá demonstrar tanto a expressão de marcadores de hepatócitos (albumina) e cholangiocytes (Krt19). A Figura 4 demonstra potencial bi-expressão de três colônias isoladas, com cerca de 25 células / colônia de 7 dias. CD133 + células-tronco do fígado normal e lesão hepática induzida quimicamente (por exemplo, dieta DDC 0,1% para 6 semanas) não vai formar tumores em camundongos nude. CD133 + células-tronco a partir de modelos específicos de genética (MAT1a – / – ou PTEN específica do fígado – / – ratos) irá formar tumores em camundongos nus se isolada no final de tarde fase de lesões pré-tumorais crônica. Este fenótipo tumor formando atualmente é identificado como uma célula-tronco do câncer 2-4 Por exemplo, o MAT1a -. / – Ratos formar tumores de fígado espontâneo em 18 semanas de idade. CD133 + células-tronco isoladas de fígado em 15-16 semanas, durante uma fase final de lesão crônica da doença de fígado, irá formar tumores em camundongos nude. A Figura 5 demonstra tumores representante de injeção bilateral de 1 x 10 6 células expandidas in vitro de um único CD133 + células-tronco do fígado. Gene Primer para a frente Primer reverso β-Actina 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' Albumina 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' Queratina 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' Tabela 1: design Primer para RT-PCR Figura 1: Esquema geral de métodos. Figura 2: CD133 + células-tronco hepáticas identificadas na altamente enriquecido CD45 esgotados fração não-parenquimatosas hepáticas Controle ileso de camundongos selvagens demonstra 0,4% CD133 + células dentro do altamente enriquecido CD45 empobrecido fracção não-parenquimatosas.. Na genética knock-out MAT1a – / -, que é um modelo de lesão hepática crônica, a população CD133 expande 10 vezes ou mais na mesma fração altamente enriquecido. Figura 3: Expansão colônias de um único CD133 + clones de contraste de fase imagens de quatro colônias derivadas de células CD133 + única expandiu laminina revestido 96 placas bem.. Figura 4:. Bi-potencial de expressão gênica de células-tronco CD133 + fígado colônias clonalmente expandiu no dia 7, as colónias são cerca de 25 células. Expressão do gene demonstra expressão do marcador marcador hepatócito Albumina e cholangiocyte Krt19, confirmando bi-potencial status de células CD133 +. Figura 5: CD133 + células-tronco do fígado formar tumores em camundongos nus As setas indicam tumores de crescimento de 4 semanas após 1×10 6 células CD133 + injetado de MAT1a – / – modelo.. CD133 + células de toxina lesão hepática crônica induzida, como CCl 4 ou 0,1% da dieta DDC, não formam tumores. Formação de tumores é usado para identificar potencial maligno, ou câncer de fenótipo de células-tronco dentro da população de células-tronco.