Con un enfoque comparativo de especies para la Investigación de Neurobiología de las respuestas Paternal

1. Identificación del modelo animal El ratón ciervo California (Peromyscus californicus) es un modelo ideal para explorar las respuestas paternas. Como puede ver, este ratón novios a los cachorros al igual que las mamás hacer – incluso agacharse sobre ellos para que se vea como los cachorros son de enfermería. El comportamiento de los ratones en comparación con California es una especie del mismo género, el ratón ciervo común (Peromyscus maniculatus) que muestra poco interés en los cachorros, a menudo tratando de escapar o incluso atacarlas. (Ver Figura 1 para las fotos de estas especies que interactúan con los cachorros.) Una vez que el modelo de las especies ha sido identificado entonces los distintos grupos deben ser establecidos. En este estudio, los padres biológicos, vírgenes sin experiencia en crianza de los hijos, y las vírgenes con una exposición limitada cachorro (cachorros expuestos o padres de crianza) de ambas especies se utilizan de modo que las características paternas tanto predispuesto y adquiridas pueden ser evaluados. En este estudio en particular que también están expuestos todos los grupos a un ratón de juguete cachorro para asegurar que las interacciones sociales son específicas de un cachorro y no una respuesta a la representante de cualquier cosa puesta en la jaula (ver Figura 2). Antes de investigar los factores neurobiológicos, es importante para confirmar que las especies seleccionadas presentan claras diferencias en la conducta de interés. En este estudio, los hombres se colocan en una jaula con un cachorro de cinco minutos y un etograma conducta paterna (véase el cuadro 1, por ejemplo, de etograma) se utiliza para las conductas puntuación como la latencia de acercarse a la cría y la cantidad de tiempo pasado en contacto con el cachorro. Si se observan las respuestas agresivas, el cachorro se elimina inmediatamente. Estas sesiones suelen ser grabadas en vídeo por lo que un cuidadoso análisis de comportamiento puede ser llevado a cabo posteriormente. 2. Preparación de tejido cerebral Después de una perfusión normal de los ratones (protocolo adjunto), el cerebro se eliminan de manera que se puede seccionar en el área específica de interés (del cerebro muestran). Un estándar de cerebro de ratón atlas (atlas muestra) se utiliza para localizar el núcleo paraventricular en el hipotálamo, un área conocida por ser rica en células que producen el neuropéptido de interés en este estudio – la vasopresina (AVP). El cerebro es entonces bloqueada y se monta en un mandril de congelación para que el tejido se congela antes de ser seccionada con el microtomo. El cerebro está seccionado en un modo de recortar hasta puntos de referencia específicos se identifican, entonces el espesor específicas del cerebro y de 30 micrones, en este caso, se establece para las secciones de cerebro que se utilizan para el análisis. Las secciones del cerebro son cuidadosamente colocadas en placas llenas de tampón fosfato salino (PBS); (protocolo de PBS adjunta, por favor, tenga en cuenta que esto es sólo un ejemplo de un protocolo de inmunocitoquímica estándar). 3. Inmunocitoquímica A lo largo de las distintas etapas de este proceso (véase el protocolo adjunto), es importante tener conocimientos precisos de pipeteo para asegurar mediciones precisas de los productos químicos y otros ingredientes importantes de esta técnica (pipeteado muestran los alumnos). El primer paso en este proceso es el lavado de los cerebros que implica la sustitución de la PBS en los pocillos tres a cinco veces, entre cada lavado los platos y se colocan en un agitador durante 10 minutos (mostrar estudiante reemplazar PBS y la colocación de placas de rockeros) . Los cortes de cerebro se exponen a la solución de anticuerpo primario y se almacenan a 4 ° C durante la noche en la mecedora (proceso de show). Después de otro lavado, las rodajas de cerebro están expuestos a un anticuerpo secundario durante una hora en el agitador a temperatura ambiente, luego se lava de nuevo. A continuación, el cerebro está expuesto a una solución compleja Avitin-biotina para prepararse para la visualización de las células neuroquímicos-positivo. Para la etapa de visualización final, el cerebro está expuesto a DAB. Este es un producto peligroso y siempre debe ser manejado con precaución. Como se ve aquí, las rodajas de cerebro comienzan a llegar más oscuro ante sus ojos (mostrar el proceso). Tras la exposición de DAB, el cerebro de pasar por la última serie de lavados y luego se colocan cuidadosamente en el microscopio subbed y se deja secar durante la noche (muestran la colocación de una porción del cerebro en un portaobjetos, ver archivo adjunto para el protocolo de diapositivas subbed). Los portaobjetos se aclaró a través de una serie de lavados de agua destilada y alcohol, finalmente quedar sumergido en Citrosolv antes de ser cubreobjetos y se almacena en un Slidebox para su custodia (mostrar los distintos aspectos de este proceso, véase el documento adjunto para el proceso de compensación). 4. Neuroquantification Después de las diapositivas se han secado, pueden ser evaluados con un software especializado neuroquantification. Aquí Bioquant software se utiliza para cuantificar las células vasopresina-positivas y las fibras en el núcleo paraventricular del cerebro del ratón (mostrará el software en la pantalla … y el microscopio). El área específica de interés se identifica con las opciones de medicióndel software para establecer el campo visual para neuroquantification. Es importante que un tamaño uniforme del campo visual se cuantifica para cada animal (los estudiantes muestran cómo hacer esto). Aquí la oscura manchada vasopresina-inmunorreactiva cuerpos de las células y las fibras son evidentes. Debido a que es difícil contar o rastrear este tejido, una característica especial de este software utiliza la luz de umbral para determinar la cantidad total de tejido con tinción positiva en el área específica de interés. Este umbral nos dice qué parte de la zona especificada contiene vasopresina tejido positivo (muestra el valor de los datos en la pantalla del ordenador). 5. Análisis del comportamiento Si más de un observador será anotar los videos, es importante para establecer confiabilidad entre los evaluadores para asegurar que los observadores están marcando el comportamiento de una manera consistente. Para la sesión de puntuación actual, una hoja de scoring de comportamiento debe estar preparado para permitir la fácil puntuación de la conducta durante las sesiones de observación (véase el cuadro 2, por ejemplo, la puntuación de hoja de cálculo). Por conductas que no son rápidos respuestas episódica, un análisis de microsecuenciación puede revelar las sutilezas de la progresión de las respuestas específicas. Por ejemplo, el aseo comportamiento consiste en una cadena de respuestas muy rápidas. Aunque es una opción para grabar sólo la presencia y duración de la preparación, otro es el de documentar la cadena de acontecimientos que acompaña a esta respuesta. El uso de este software microsecuenciación, los observadores de puntuación de la presencia de un comportamiento particular en cada segundo, como lo solicite el software (software de demostración y de vídeo). Tras la recogida de datos, los parámetros de interés se determinan y los resultados del comportamiento apropiado analizados. Ejemplos pueden ser la duración total del tiempo pasado en contacto con el cachorro, o el número de interrupciones en la secuencia de preparación (mostrar ordenador con hoja de cálculo con los datos introducidos por cada animal). Una vez que la conducta se califica, es importante para confirmar que las dos especies exhiben diferentes estrategias de respuesta para la conducta de interés en el estudio. En este caso los ratones ciervo de California deben mostrar un comportamiento más paternal que los ratones ciervo común. Además, varias medidas del comportamiento pueden ser correlacionadas con las medidas del cerebro para obtener una visión más informada de las influencias relevantes. 6. Los resultados representativos: Para validar el modelo, los datos deben indicar claramente que las dos especies realiza de forma diferente con respecto a la conducta de interés. Aquí se ve que el P. hombres californicus pasado más tiempo de aseo y en cuclillas sobre los cachorros, dos señas de identidad de las respuestas paternas (ver Figura 4). Con el fin de determinar si la variable de interés neurobiologial es importante en las respuestas paternas, la cantidad de vasopresina (AVP), tejido positivo se cuantificó por varias áreas cerebrales relevantes, como puede verse, el paternal P. animales californicus había tejido más inmunes positivos en varias de estas áreas del cerebro. (Ver Figura 5). En un estudio relacionado con el análisis de microsecuenciación, se planteó la hipótesis de que los ratones paterna California se muestran menos ansiedad que sus homólogos de la Virgen, en consecuencia, cuando se expone al olor de un depredador, los padres mostraron menos interrupciones en la secuencia de preparación de los animales vírgenes (véase la Figura 6). Figura 1: (A) Hombre de California ratones con respuesta paterna hacia la misma especie alienígena cachorro. (B) ratón ciervo macho mostrando una actitud prudente (tramo de asistir) y la respuesta de evitación de la presencia de un extranjero cachorro misma especie. Nota: En estas evaluaciones la interacción social, si un varón presenta las respuestas agresivas hacia el cachorro, los experimentadores de inmediato golpeó la parte superior de la jaula para distraer a los hombres. En este momento se termina la sesión y el cachorro se retira, inspeccionada por cualquier herida y regresó a la madre. En nuestro laboratorio, esto rara vez se observa con P. californicus, pero los hombres se observa ocasionalmente con P. maniculatus, observación e intervención inmediata, sin embargo, evitar que se produzcan daños a los animales. Figura 2: Un ratón California interactuar con un ratón de juguete, la mayoría trató de masticar estos estímulos. Figura 3: El diseño experimental del estudio, había alrededor de 6 animales en cada grupo para cada especie. Figura 4: Gráfico del proceso de inmunocitoquímica. HigoUre 5 respuestas Paternal en el California y los ratones ciervo;. respuestas más paternal (el novio, agacharse, más rápido de aproximación) se observaron en los ratones California. Más tramo asiste (respuesta al estrés) se observaron en los ratones de los ciervos. Figura 6. Inmunorreactividad vasopresina en distintas áreas cerebrales de ambas especies. Los ratones de California había más manchas en las células y las fibras de PVN. Figura 7: Paternal ratones California mostraron menos interrupciones en sus secuencias de limpieza en la presencia de olor de un depredador que los grupos de títeres expuestos y virgen.