Mit einem vergleichenden Arten Ansatz zur Neurobiologie der väterlichen Responses Untersuchen

1. Identification of Animal Modell Die California Deer Mouse (Peromyscus californicus) ist ein ideales Modell, um väterliche Reaktionen zu erforschen. Wie Sie sehen, Pfleger diese Maus die Welpen ebenso wie die Mütter tun – sie haben sogar kriechen über sie, so dass es wie die Welpen stillen sucht. Das Verhalten der California Mäusen ist es, eine Art derselben Gattung, die gemeinsame Rehe Maus (Peromyscus maniculatus), die wenig Interesse an den Welpen Ausstellungen, oft auf der Flucht oder gar angreifen verglichen. (Siehe Abbildung 1 für die Bilder von diesen Arten der Interaktion mit Welpen.) Sobald die Spezies-Modell identifiziert wurde dann die verschiedenen Gruppen müssen noch festgelegt werden. In dieser Studie werden biologische Väter, Jungfrauen ohne Eltern erleben, und Jungfrauen mit beschränkter pup Exposition (Welpe ausgesetzt oder Pflegeeltern Väter) der beiden Arten, so dass beide veranlagt und erwarb väterliche Merkmale beurteilt werden kann, verwendet. In diesem speziellen Studie, die wir auch alle Gruppen, um ein Spielzeug Maus pup, um sicherzustellen, dass die sozialen Interaktionen spezifisch für ein Welpe und nicht um eine repräsentative Antwort auf alles in den Käfig gesetzt wurden ausgesetzt (siehe Abbildung 2). Vor der Untersuchung neurobiologische Faktoren ist es wichtig, zu bestätigen, dass die ausgewählten Arten deutliche Unterschiede im Verhalten von Interesse zu zeigen. In dieser Studie sind Männer in einem Käfig mit einem Welpen für fünf Minuten und eine väterliche Verhalten Ethogramm (siehe Tabelle 1 zum Beispiel der Ethogramm) gelegt wird ein Tor Verhaltensweisen wie Latenz verwendet werden, um den Welpen und viel Zeit in Kontakt mit abgebrannten Ansatz den Welpen. Wenn aggressive Reaktionen beobachtet werden, ist der Welpe sofort entfernt. Diese Sitzungen sind oft auf Video aufgezeichnet, so eine sorgfältige Verhaltensanalyse später durchgeführt werden können. 2. Vorbereitung Gehirngewebe Nach einer Standard-Perfusion jeder Maus (Protokoll im Anhang), sind die Köpfe, so dass sie zu zerschneiden in den speziellen Bereich von Interesse (zeige Gehirn) entfernt. Eine Standard-Maus Hirnatlas (zeige atlas) dient dazu, die Nucleus paraventricularis im Hypothalamus, einem Gebiet reich an Zellen, die das Neuropeptid von Interesse in dieser Studie zu finden – Vasopressin (AVP). Das Gehirn ist dann gesperrt und auf einem Einfrieren Futter, so dass das Gewebe vor dem Schnitt mit dem Mikrotom einfrieren wird. Das Hirn ist im Schnitt in ein Trimm-Modus, bis bestimmte Landmarken identifiziert werden, dann ist die spezifische Gehirn Dicke 30 Mikron in diesem Fall ist für das Gehirn Abschnitte für die Analyse verwendet wird. Das Gehirn Abschnitte sind sorgfältig in Well-Platten mit Phosphatpuffer (PBS) gefüllt; (Protokoll für PBS beigefügt; Bitte beachten Sie, dass dies nur ein Beispiel für eine Standard-Immunzytochemie Protokoll). 3. Immunzytochemie Während die verschiedenen Schritte dieses Prozesses (siehe beigefügte Protokoll), ist es wichtig, genaue Pipettieren Fähigkeiten, um genaue Messungen von Chemikalien und anderen Zutaten wichtig sicherzustellen, für diese Technik (zeige Schüler Pipettieren) haben. Der erste Schritt in diesem Prozess ist das Waschen der Gehirne, die anstelle der PBS in der Well-Platten drei vor fünf Mal beinhaltet, zwischen jedem Waschgang die Well-Platten sind auf einer Wippe für 10 Minuten gelegt (show Schüler ersetzen PBS und Platzierung Well-Platten auf Rocker) . Die Hirnschnitten werden dann an den primären Antikörper-Lösung ausgesetzt und bei 4 ° C über Nacht auf der Wippe (show-Prozess). Nach einem weiteren Waschschritt werden die Hirnschnitten zu einem sekundären Antikörper für eine Stunde auf der Wippe bei Raumtemperatur ausgesetzt, dann erneut gewaschen. Als nächstes werden die Gehirne sind zu einem Avitin-Biotin-Komplex-Lösung für die Visualisierung der neurochemischen-positive Zellen herzustellen ausgesetzt. Für die endgültige Visualisierung Schritt werden die Gehirne DAB ausgesetzt. Dies ist ein gefährliches Produkt und sollte immer mit Vorsicht behandelt werden. Wie hier zu sehen, beginnen die Hirnschnitten zu dunkler vor Ihren Augen (show-Prozess). Nach dem DAB Exposition, die Gehirne durch die letzte Reihe von Waschungen zu gehen und sich dann vorsichtig auf subbed Objektträger gebracht und über Nacht trocknen gelassen (zeige die Platzierung einer Hirnschnitt auf einer Folie, siehe Anlage subbed Folien-Protokoll). Die Objektträger werden dann durch eine Reihe von destilliertem Wasser und Alkohol wäscht gelöscht, endlich in Citrosolv bevor sie eingedeckt und in einer SlideBox zur sicheren Aufbewahrung (zeigen verschiedene Aspekte dieses Prozesses, siehe Anhang für das Clearing-Verfahren) gespeichert unter Wasser. 4. Neuroquantification Nach dem Objektträger getrocknet sind, können sie mit spezialisierten neuroquantification Software beurteilt werden. Hier Bioquant Software wird verwendet, um den Vasopressin-positive Zellen und Fasern in den Nucleus paraventricularis der Mäusehirne quantifizieren (show-Software auf dem Bildschirm … und Mikroskop). Die spezifischen Bereich von Interesse ist, die anhand des Messmöglichkeitender Software, um das Gesichtsfeld für neuroquantification etablieren. Es ist wichtig, dass eine konsistente visuelle Feldgröße für jedes Tier wird quantifiziert (zeige Schüler tun). Hier werden die dunkel gefärbten Vasopressin-immunreaktive Zellkörpern und Fasern sind erkennbar. Weil es schwierig ist, zu zählen oder zu verfolgen dieses Gewebe, verwendet ein spezielles Merkmal dieser Software Licht Schwellenwert für die Gesamtmenge der positiv gefärbten Gewebe innerhalb des angegebenen Bereichs von Interesse zu bestimmen. Dieser Schwellenwert erzählt uns, wie viel von den angegebenen Bereich enthalten Vasopressin-positive Gewebe (zeigen die Daten, Wert auf dem Bildschirm). 5. Behavioral Analysis Wenn mehr als ein Beobachter Scoring wird die Videobänder, ist es wichtig, Interrater-Reliabilität zu etablieren, um sicherzustellen, dass die Beobachter sind Scoring das Verhalten in einer konsistenten Art und Weise. Für die eigentliche Scoring-Sitzung sollte ein Verhaltens-Scoring Blatt bereit, für eine einfache Scoring-Verhalten während der Beobachtung Sitzungen zu ermöglichen (siehe Tabelle 2 zum Beispiel von Scoring-Tabellenkalkulation) werden. Für Verhaltensweisen, die nicht schnell episodischen Reaktionen kann ein Mikrosequenzierung Analyse zeigen Feinheiten über den Verlauf der spezifischen Reaktionen. Zum Beispiel, Fellpflege Verhalten besteht aus einer Kette von sehr schnellen Antworten. Obwohl eine Option ist, einfach erfassen das Vorhandensein und die Dauer der Pflege, ist eine andere, die Kette der Ereignisse zu dieser Reaktion zu dokumentieren. Mit dieser Mikrosequenzierung Software Score Beobachter die Anwesenheit eines bestimmten Verhaltens jeder zweite, wie von der Software (show-Software und Video) dazu aufgefordert werden. Nach der Datenerhebung werden die Parameter von Interesse bestimmt und die entsprechenden Verhaltensweisen Noten werden analysiert. Beispiele können Gesamtdauer der Zeit in Kontakt mit den Welpen, oder die Anzahl der Störungen in der Pflege-Sequenz (zeige Computer mit Tabellenkalkulation mit Daten für jedes Tier eingegeben) ausgegeben werden. Sobald das Verhalten erzielt wird, ist es wichtig zu bestätigen, dass die beiden Arten unterschiedliche Bewältigungsstrategien ausgestellt für das Verhalten von Interesse in der Studie. In diesem Fall ist der California Hirsche Mäusen sollte mehr väterliche Verhalten als die gemeinsame Hirsche Mäusen. Darüber hinaus können verschiedene Verhaltensmaßnahmen mit Gehirn Maßnahmen korreliert werden, um eine fundierte Analyse relevanten Einflüsse zu bekommen. 6. Repräsentative Ergebnisse: Zur Validierung des Modells sollten die Daten zeigen deutlich, dass die beiden Arten unterschiedlich ausgeführt im Hinblick auf das Verhalten von Interesse. Hier sehen Sie, dass die P. californicus Männer verbrachten mehr Zeit Pflege und geduckt über die Welpen, zwei Markenzeichen des väterlichen Antworten (siehe Abbildung 4). Um festzustellen, ob die neurobiologial Variable von Interesse ist in väterliche Reaktionen wichtig, die Menge an Vasopressin (AVP)-positive Gewebe wurde für mehrere relevante Hirnregionen quantifiziert; wie man sieht, das väterliche P. californicus Tiere hatten mehr immun-positive Gewebe in mehreren dieser Hirnregionen. (Siehe Abbildung 5). In einer ähnlichen Studie mit dem Mikrosequenzierung Analyse wurde die Hypothese aufgestellt, dass väterliche California Mäuse würden weniger Angst als ihre Pendants Jungfrau zeigen, dementsprechend, wenn ein Raubtier Geruch ausgesetzt sind, zeigten die Väter weniger Unterbrechungen in der Pflege-Sequenz als die jungfräuliche Tiere (siehe Abbildung 6). Abbildung 1: (A) männlich California Mäusen ausstellenden väterliche Reaktionen gegenüber Artgenossen fremd pup. (B) Männliche Hirsche Maus präsentiert einen vorsichtigen Ansatz (Stretch teilnehmen) und die Vermeidung Reaktion in Anwesenheit eines Artgenossen fremd pup. Hinweis: In dieser sozialen Interaktion Einschätzungen, wenn ein Männchen Exponate aggressive Reaktionen auf die Welpen, die Experimentatoren sofort auf den Spitzenplätzen der Käfig mit dem männlichen abzulenken. Zu diesem Zeitpunkt die Sitzung beendet wird und der Welpe wird entfernt, inspiziert für alle Wunden und kehrte nach der Mutter. In unserem Labor, das selten mit P. beobachtet californicus Männchen, sondern ist gelegentlich mit P. beobachtet maniculatus; genaue Beobachtung und sofortiges Eingreifen, aber Schlimmes verhindern das Auftreten von den Tieren. Abbildung 2: A California Maus Interaktion mit einem Spielzeug-Maus, die meisten versuchten, auf diese Reize zu kauen. Abbildung 3: Experimentelles Design der Studie, es gab ca. 6 Tiere in jeder Gruppe für die einzelnen Arten. Abbildung 4: Grafik der Immunzytochemie Prozess. FeigeAbbildung 5 Paternal Reaktionen in der kalifornischen und Rehe Mäusen;. mehr väterliche Antworten (Bräutigam, ducken, schneller Ansatz) wurden in der kalifornischen Mäusen beobachtet. Mehr Stretch besucht (Stress-Reaktion) wurden in der Hirsch-Mäusen beobachtet. Abbildung 6. Vasopressin-Immunreaktivität in verschiedenen Gehirnarealen von beiden Arten. Die California-Mäusen hatten mehr Färbung in den PVN Zellen und Fasern. Abbildung 7: Väterliche California Mäuse zeigten weniger Störungen in ihrer Pflege-Sequenzen in der Gegenwart von einem Raubtier Geruch als der Welpe ausgesetzt und Jungfrau Gruppen.