التعبئة والتغليف بفيروس نقص المناعة البشرية أو FIV المستندة إلى محددات التعبير Lentivector وتنبيغ من الجزيئات VSV-G الفيروسية Pseudotyped
Summary
ناقلات التعبير Lentiviral هي الوسائل الأكثر فعالية للتعبير عن جزيئات ستابلي المستجيب مختلفة أو يبني صحافي في تقسيم وغير تقسيم خلايا الثدييات والكائنات كلها. هنا نقدم بروتوكول بشأن كيفية حزم بنيات التعبير lentivector في جزيئات pseudoviral وtransduce الخلايا المستهدفة باستخدام جزيئات pseudoviral.
Abstract
As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7.
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter.
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein.
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.
Protocol
Discussion
وقد تم تحسين هذه التعبئة والتغليف الفيروسية وتنبيغ من بروتوكول الخلايا المستهدفة للاستخدام مع الكواشف الهيئة الفرعية للتنفيذ في التعبئة والتغليف الفيروسية. قد استبدال الكواشف الأخرى التي تؤثر على نتائج بروتوكول. فقط وقد تم هذا البروتوكول الأمثل لإنتاج lentiviral و قد لا تكون مناسبة لإنتاج أنواع أخرى من الفيروسات أو pseudoviruses.
التعبئة والتغليف الفيروسية الناجحة تعتمد على عدة خطوات رئيسية. الخلايا 293TN تعبر عن SV40 مستضد تي كبير، وهو أمر ضروري للغاية لإفراز الجزيئات lentiviral في الخلية طاف ثقافة. كثافة في الخلايا التي هي 293TN في وقت ترنسفكأيشن أهمية خاصة من أجل أن كاشف PureFection لنقل بما فيه الكفاية lentivector والبلازميدات التعبئة والتغليف في الخلايا. واضاف ان خليط PureFection إلى الأنسجة لوحة الثقافة بطريقة الإفلات من الحكمة تليها يحوم بدقة في لوحة من المهم للتشتت البلازميدات التعبئة والتغليفوlentivector بناء في جميع الخلايا. قد فشل في توزيع مناسب للناقلات ينتج جسيمات lentiviral غير كاف يتم إنتاجها. يمكن زيادتها رد فعل التعبئة والتغليف الفيروسية تصل لإنتاج فيروس عيار عالية، وبناء على المساحة السطحية للوحات زراعة الأنسجة. ويمكن للمرء أن يختار لعدة أطباق لوحة زراعة الأنسجة من خلايا 293TN في التصور الذي يجب تعبئتها. تركيز supernatants الفيروسية مفيد بشكل خاص في خلق رفيع عيار الفيروس. ويمكن الجمع بين طاف الفيروسية من لوحات متعددة من الخلايا والتي ركزت في لاستخدامها في التجارب المجراة، أو للخلايا التي يصعب transduce.
Titering الجزيئات تنتج lentiviral المهم لحساب دقيق وزارة الداخلية لاستخدامها لتنبيغ من الخلايا المستهدفة. معرفة وزارة الداخلية التي تم استخدامها في تنبيغ نظرا تمكن مخرج في حال أن تنبيغ غير الناجحة. على سبيل المثال، باستخدام وزارة الداخلية التي هيقد منخفضة للغاية تؤدي إلى الخلايا المستهدفة عدد قليل جدا من التعبير عن التصور في المصالح. تستخدم وزارة الداخلية التي هي عالية جدا، ومع ذلك، قد يؤدي إلى الخلايا المستهدفة التي تظهر علامات الإجهاد. والهدف من ذلك هو استخدام وزارة الداخلية والتي تزيد التعبير عن التصور، من المصلحة مع الحفاظ على صحة الخلايا. في حين أننا نقترح على بروتوكول titering qPCR مقرها الذي يقيس نسخا متكاملة من التركيبة lentiviral HT1080 في الخلايا، ويمكن أيضا النهج titering أخرى يمكن استخدامها، مثل ELISA P24 أو تقدير في المئة من GFP إيجابية الخلايا.
تنبيغ ناجح من الخلايا المستهدفة هي أيضا تعتمد على عدة عوامل رئيسية. TransDux هو كاشف عدوى فريدة من نوعها التي تمكن الكفاءات تنبيغ عالية، ولكن ليست سامة للخلايا. ويمكن استخدام TransDux بدلا من polybrene، التي غالبا ما تكون سامة للخلايا المستهدفة. إدراج TransDux في تنبيغ من الخلايا المستهدفة تساعد على إزالة الرسوم على الجسيمات الفيروسية، وتتيح للفيروس في الخليةق. منذ TransDux ليست سامة للخلايا، يمكن للمرء أن يسمح للجزيئات lentiviral أن يبقى على اتصال مع هذه الخلايا لمدة تصل إلى 72 ساعة (في الوقت الذي يبني الفيروسية ودمجها في جينوم الخلية المضيفة)، وبالتالي زيادة احتمال لل الجسيمات الفيروسية دخول الخلية. بالنسبة لبعض الخلايا التي يصعب transduce، ويمكن تكرار transductions في أيام متتالية لتعزيز كفاءة تنبيغ. على سبيل المثال، transduce الخلايا في اليوم 1، تسمح للخلايا للراحة في يوم 2، وtransduce ثم الخلايا مرة أخرى في اليوم 3. من المهم أن ننتظر 72 ساعة بعد وتنبيغ الأخيرة قبل اختيار بداية، تجارب أخرى أو توصيف الخلايا المستهدفة.
التعبئة والتغليف فيروسي فعال يعتمد أيضا على حجم التركيبة lentiviral، بين '(5)، والمناطق 3'LTR. يجب أن هذا الجزء من التركيبة lentiviral يكون ما يقرب من 9 كيلو بايت أو أقل، وهو ما يعادل حجم الجينوم فيروس نقص المناعة البشرية الوطنية. تتجاوز 9 كيلوبايت مايو ديتجعيده عيار الجسيمات pseudoviral المنتجة. التكنولوجيا الجديدة، مثل ناقلات ينقول piggyBac، والسماح للتكامل وموثوق بها مستقرة من الجينات المحورة تصل إلى 100 كيلوبايت من خلال ترنسفكأيشن واحد. ويمكن استخدام هذا النهج لبنى التي تتجاوز الحد الأقصى لحجم لناقلات lentiviral، في الحالات التي من الممكن أن transfect الخلايا المستهدفة، ويوفر ميزة إضافية لا تتطلب خطوة التعبئة والتغليف 9،10 الفيروسية.
الجزيئات pseudoviral المنتجة باستخدام هذا البروتوكول هي المعدية وذلك لأنها يمكن أن تصيب معظم أنواع الخلايا الثديية. المنتجات المستخدمة في هذا البروتوكول، ولكن الجيل الثالث من biosafe في أنها تنتج غير قابلة للتكرار وpseudoviruses الذاتي تعطيل. ولذلك، transduced مرة واحدة في الخلايا المستهدفة أو الحيوانات، والخلايا المستهدفة أو الحيوانات ليست وبائية أو معدية. استبدال البلازميدات lentivector الأخرى التي ليست من الجيل الثالث biosafe ممكن على الرغم من أن لا ينصح من سلامة الأحيائيةمنظور. وينبغي تنفيذ بروتوكول الانتاج الفيروسية وتنبيغ اللاحقة من الخلايا المستهدفة تحت مستوى السلامة الأحيائية 2، وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة 11، والباحثين وينبغي دائما ارتداء معطف مختبر وقفازات عند التعامل مع الجسيمات الفيروسية. استخدام الخلايا المنتجة 293TN، ينبغي التخلص منها أنابيب من الجسيمات الفيروسية، وماصات القابل للصرف في حاوية 1 اقية مناسبة. وينبغي تطهير الماصات قابلة لإعادة الاستخدام والأواني الزجاجية مع التبييض وجهاز الأوتوكليف لتقليل التعرض للأفراد.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف الموظفين والعلماء في الهيئة على دعمهم في تطوير واختبار هذه البروتوكولات.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11995-073 | |
| 293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
| pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
| pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
| Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
| PureFection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 |
|
| PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 |
|
| Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
| TransDux | SBI | LV850A-1 |
References
- Cann, A. J. . RNA Viruses. A Practical Approach. , (2000).
- Gould, D. J., Favorov, P. Vectors for the treatment of autoimmune diseases. Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Dull, T., Zufferey, R. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Federico, M. . Lentivirus Gene Engineering Protocols. , (2003).
- Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).
- Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Mol. Cell Biochem. , (2011).
