DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

亜硫酸変換プロトコルゲノムDNAの2μgの変換のための標準プロトコルを以下に説明されています。ゲノムDNA（100 pgの-200μgの）のより小さいか大きい金額も正常に処理された亜硫酸することができます。これらの反応条件は、ほぼすべての標的DNA配列3の完全な転換（99.5から99.7パーセント）になります。 1。 DNAの調製 37℃の注で1時間、18μLの総体積で重亜硫酸DNAの溶解バッファー（2μgのトン RNA、280 ng /μLのプロテイナーゼK、1％SDS）でゲノムDNAをインキュベートすることにより、サンプルを準備します：これは達成することが重要です。特に、まだDNAに関連するタンパク質が存在する可能性がある臨床検体から分離されたDNAと最大重亜硫酸変換、。 2。 DNAの変性最後のcに用時調製した3MのNaOH2μlを添加することにより20μlの体積で変性2μgのDNA0.3Mのonc​​entration。 37サンプルをインキュベートしますヒートブロックで2分間90℃でインキュベートした水浴中で15分間、。直ちに氷上で5分間チューブを置きます。 10,000 gで10秒° Cは、DNAがチューブの底にあることを確認するために4でチューブを遠心する。 3。亜硫酸脱アミノ化スルホン化＆加水分解脱アミノ化 10 mMのキノールとナトリウム飽和亜硫酸液pH 5.0（10 M NaOHを464μLの7.6グラムのNa 2 S 2 O 5、水で15mlになる）の新鮮な溶液を調製。飽和重亜硫酸ナトリウムの溶液を最小混合と曝気と、ゆるやかに転倒試薬/ H 2 Oの混合物によって達成されます。必要に応じて、メタ重亜硫酸の完全な溶解のために、10 M NaOHでpHを調整する注：それは飽和溶液であるため、小さなしこりがまだ溶け残る場合があります。 208を追加飽和メタ重亜硫酸及び2.31M bisulphite/0.5mMキノールの最終濃度〜240μlの最終容量で変性したDNA（20μL）、、pHは5.0〜10mMのキノールの12μlを添加。優しくチューブの底にある液滴のすべてを確実にするために10秒間すべての試薬と遠心を混ぜる。 ミネラルオイル200μlのサンプルをオーバーレイ。 ℃の水浴中で、4〜16時間を55でサンプルをインキュベートする。亜硫酸治療の長さが変換されるDNAの量と質に依存しています。低品質や劣化したDNAのDNAの場合は、4時間にインキュベーション時間を制限する注：それはそれはインキュベーション前にホイルにチューブ可能ラップがないようなら、その重亜硫酸変換は酸化を避けるために、暗闇の中で行われることが重要です。 。 適切なインキュベーション時間の最後に、すべての液体がチューブの底にあることを確認するために微量遠心機でチューブを軽くスピン。 亜硫酸処理されたDNAを回収する慎重に鉱物油のいずれかを取ることなく、チューブの底からDNA溶液をピペッティングによりオイルの層の下から。 脱塩脱塩カラムを通過し、ミリQ水（MQH 2 O）の50μlで溶出することにより任意のフリー亜硫酸イオンを取り外します。ゲノムDNAの量と質にし、それがどのように準備される応じて、別の脱塩カラムを使用することができます。我々は、日常的にこれらの列は、変換の前にDNAの調製に使用されるSDSを除去するのに適しているとしてプロメガウィザードは、列をクリーンアップします。 アルカリ脱スルホン重亜硫酸付加物は、脱スルホンによってウラシル環から削除されます。 0.3Mの最終濃度に調製したばかりの3M NaOHを5.5μlを添加することによりDesulphonateは、その後37℃で15分間サンプルをインキュベートする。 短時間遠心し 、t RNA（10 mg / ml）を1μlを加える。 <liは>酢酸アンモニウム（NH 4 O AC）、3Mの最終濃度までのpH 7.0の33μlの添加によるソリューションを中和します。 氷冷100％エタノール330μlを添加してDNAをエタノール沈殿させ、反転によりよく混ぜる。一晩に1時間で-20μC残す。 4時15分、14,000 gで遠心する℃、上清と空気のすべての痕跡〜20分間沈殿したDNAを乾燥させて取り外します。 0.1 TE（10mMのトリス- HCL、0.1mmのEDTA、pH8.0）をまたはH 2 O50μlの/μgのでDNAペレットを再サスペンド約2時間室温で残す。 DNAを確実にするために時々ボルテックスチューブは、迅速な遠心分離に続いて、溶解させる。 DNAの量と質に応じて10から10年間、-20℃でPCR増幅、または店のためにすぐに使用してください。 4。 PCR増幅プライマーの設計 PCR亜硫酸変換特異的プライマーの効果的なデザインは、cruciaです完全に変換したDNAの効率的、公平な増幅が起こることを確保するためのリットル。次のガイドラインは、プライマーの設計を支援するために使用されています。 プライマーの設計ガイドライン Thermocyling メチル化及び非メチル化DNAの比例PCR増幅のためにテストするには、50:50メチル/非メチル化を完全に亜硫酸変換制御のサンプルを使用して最適化されたPCRの反応条件（図3）の下で亜硫酸変換特異的プライマーを用いて増幅する。 50:50メチル化の場合：非メチル化コントロール、 体外 SSSIメチル化DNAとのいずれかの全ゲノム増幅（WGA）のDNAまたは全血のDNA の使用。いくつかの遺伝子が自然に血液中のメチル化、したがって、これらの場合にのみ、"非メチル化"コントロールとしてWGA DNAを使用するのがベストだとされますのでご注意ください。 100＆mのPCR増幅反応混合物を準備するU;重亜硫酸変換したゲノムDNA、200μMのdNTPの、1μMのプライマー、1.5mMのMgCl 2、50mMのKClを、10mMのトリス- HCL、pH8.3中、0.15μlのTaqポリメラーゼ 2μlを含むLアリコート。 3℃でプライマーの予測されたTm値から10本 – 温度勾配のサーモサイクラーでは、勾配のラン反応+ /を設定するメチル化及び非メチル化アンプリコンが比例して増幅されていることをテストするために、アンプリコンは、メチル化DNAを消化し ​​ますが、制限酵素サイトがあるときに非メチル化DNAを消化し ​​ないようなTaqポリメラーゼ 1（TCGA）などの有益な制限酵素、、で消化することができますTTGAに亜硫酸変換後に変更。消化の程度は、アガロースゲル電気泳動（図3A）により可視化することができます。また、SYBRGreen（1:1000希釈の0.2μl）をPCR反応に加えることができるとメチル化の程度は、リアルタイムPCRサーモサイクラー（図3B）の熱解離のプロットを行うことにより評価することができる。 MgCl 2濃度と熱サイクル条件を含むPCR反応ミックスは、PCRの効率を向上させたり、メチル化及び非メチル化PCRフラグメントの比例PCR増幅を確実にするために調整する必要があります。 PCR条件が最適化されると、PCR増幅は、重亜硫酸変換のサンプルで実行することができます注：。一度Tm値は、温度勾配PCR法は、使用される必要はない最適化されています。 5。代表的な結果： 亜硫酸PCR増幅の最適化の例を図3に示されています。最適なPCR増幅の条件は、比例して、バイアスのないメチル化及び非メチル化アンプリコンを増幅する必要があります。図3Aは50％、メチル化及び非メチル化DNAの混合物から温度勾配PCR増幅のプロファイルを使用してアガロースゲルを示しています。目電子PCRアンプリコンは、メチル化（M）DNAを消化し ​​ますが、制限酵素部位としてメチル化（U）DNAを消化し ​​ない制限酵素、Taqポリメラーゼ 1（TCGA）、治療を受けていますTTGAに亜硫酸変換によって変更されます。メチル化及び非メチル化DNAが比例して増幅される場合にはカットとカットされていないPCR産物の等しい量が期待されている。それは、非バイアス増幅のための最適なthermocyling条件は56.1℃で（T）であることをこのゲルに見ることができます。亜硫酸DNAの完全な変換はまた、 パアン III（CCGG）などのシトシン-サイト固有の酵素による消化によって分析することができます。変換が失敗した場合パアン IIIは、唯一の制限部位が維持されるため、消化されます。変換が完了されている場合は制限酵素サイトはTCGGまたはDNAのメチル化状態に応じてTTGGに変換されます。亜硫酸DNA変換を完了し、図3A（H）で見ることができます。 図3Bは、リアルタイムでの解離のプロットを示していますまた、別の分子が解離する温度に基づいて任意の増幅の偏りがあるかどうかを判断するためのツールと​​して使用することができます。この図では、PCRが82.1​​μCで解離完全にメチル化及び非メチル化DNAの制御増幅に比べて50％メチル化及び非メチル化DNAの混合物からの割合でメチル化増幅さ（M）と非メチル化（U）DNAていることがわかるそれぞれ78.9μC。 thermocylingと反応条件の最適化後に重亜硫酸処理されたサンプルは、1つまたはセミネストPCR反応のいずれかで鎖の特定と亜硫酸特異的プライマーで増幅することができる。得られたPCR断片は、アガロースゲル電気泳動によって可視化し、直接（図4A）またはクローニングとシークエンシングにより配列決定することができます。クローニングと個々の分子のメチル化状態をシークエンシングは、の不均一性を可視化するために、重亜硫酸マップ（図4B）で、表形式で表すことができます後メチル化。 ハイスループット定量的なメチル化の解析は、シーケノムのEpiTYPERの方法によって利用されるそのような技術を使用して予備成形することができます。この方法を使用して、重亜硫酸変換したDNAを重亜硫酸特異的なPCRプライマーで増幅し、proprietry切断プロセスが続きます。得られた断片をメチル化シトシン（図5A）の存在に依存して特定のスペクトルとMALDI – TOF質量分析法によって定量される。サンプル中のメチル化率の要約は、エピグラム（図5B）またはメチル化のプロット（図5C）の形で外挿することができます。 図1。メチル化CpG回路図。遺伝子の本体内のCpGサイトが疎と（赤）一般的にメチル化されているのに対し、正常細胞では、プロモーター、関連するCpGアイランドは、主に（灰色）非メチル化されています。右側のパネルには、分子構造体を拡張個々のCpGサイトにおけるDNAのUREとシトシンの炭素5のCH3分子とメチル化を示しています。 図2。化学変換の回路図 DNAメチル化の分析のように4つの主な段階が含まれ、。変性、亜硫酸変換、PCRの増幅と解析を。右側のパネルでは、重亜硫酸変換中に発生したシトシン分子への変更が描かれている。 図3。 PCR増幅。A.の最適化 50パーセントメチル化及び非メチル化DNAの混合物から温度勾配PCR増幅のプロファイルを使用してアガロースゲル電気泳動。フラグメントは、それぞれメチル化DNAと非重亜硫酸変換したDNAを消化Taq1（T）またはHpaIII（H）のどちらかで消化されています。 B.熱解離曲線解析では、方程式を示しています。82.1での解離の制御を完全にメチル化の増幅（ピンクライン、M）と非メチル化DNA（緑のライン、U）に比べて、メチル化及び非メチル化DNAのL比率（赤線50/50ミックス）° Cと78.9 ° Cであった。 図4。ダイレクトシークエンシングと亜硫酸マップの例。A.黄色で強調表示さCpG部位を持つ3つの別の細胞株からのシーケンスのトレース。セルの線YとZはG /信号を重ねて見られるようにメチル化の度合いを示すのに対し、セルの行Xは、3つすべてのCpGサイトで100％のメチル化が表示されます。として個々のクローンのダイレクトシークエンシングによって決定される個々のCpG部位のメチル化の密度を示すB.描写亜硫酸マップ（赤い点）、。 <bR /> 図5。シーケノム。Aを用いた高スループットのDNAメチル化解析シーケノムepiTYPERの技術を使用してスペクトラムビュー。 DNA断片は、DNAメチル化の存在量に応じて、特定のスペクトルが表示されます。つの異なる細胞株のための各CpGサイトにおけるDNAメチル化の割合のB.エピグラムは、要約。シーケノムの警句から派生したC.メチル化のプロットの要約。