Procedures voor Rat<em> In situ</em> Skeletspier contractiele eigenschappen

1. Introductie De MacIntosh lab is met behulp van de mediale gastrocnemius spier voorbereiding voor meerdere jaren, en daarvoor, de hele gastrocnemius spier voorbereiding, zoals ontwikkeld met Dr Phil Gardiner. 1 2. Anesthesie Volwassen Sprague-Dawley ratten (200-300 g) worden doorgaans gebruikt in ons laboratorium voor de studie van contractiele eigenschappen in situ. De rat kan worden belemmerd in een plexiglas apparaat commercieel verkrijgbaar, of door het bedekken met een handdoek te houden. We gebruiken ketamine / xylazine (100 mg · ml -1, elk) gemengd in 85:15 en beheert 0,1 ml per 100 g rat gewicht intramusculair 2,3. Natriumpentobarbital (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) of isofluraan (2-3,5%, inhalatie) kan ook worden gebruikt 4. Terwijl de verdoving van kracht worden, kan een precieze gewicht worden verkregen en de linker achterste ledematen geschoren. Dit is ook een goede time om er zeker van alle elektronica is ingeschakeld en klaar. Dit geldt ook voor computers, rekstrook versterker, oliekachel en anderen. Controleer voor de terugkeer van reflex periodiek en aanvulling van de anesthesie als nodig is (0,05 tot 0,1 ml per 100 g). 3. Initiëren Heelkunde We maken gebruik van een plexiglas platform om de rat voor een operatie te immobiliseren. Eenvoudige afplakband doet het werk. Zorg ervoor dat het dier wordt uitgerekt van links achterbeen naar rechts voorpoot. Voeg een druppel smeermiddel voor de ogen. We gebruiken paraffineolie. Anders zal de ogen uitdrogen met ketamine anesthesie. Een kleine chirurgische licht is nuttig. Deze geeft genoeg warmte om te helpen het dier warm te houden. Alternatief kan een water verwarmingsdeken worden gebruikt. Controleer of het hoornvlies of teen-snuifje reflexen afwezig zijn voordat u verder gaat. Steriele techniek is niet nodig, omdat deze procedure acute. Het dier zal niet herstellen van de narcose. We euthanaseren de rat met verdovingoverdosering (0,2 ml, intracardiale) als alle procedures zijn voltooid. De eerste incisie door de huid van de hiel aan de wervelkolom. We schaar, omdat de diepte van de snede kan worden geregeld en de schaar gebruikt om de huid los van de onderliggende weefsels. Ratten hebben een uitstekende hemostase, dus zo lang als je grote bloedvaten te voorkomen, bloedingen beperkt zal zijn. Houd blootgestelde oppervlakken bedekt met isotone zoutoplossing gedrenkte gaas, waar mogelijk. Nadat de huid is gescheiden van het onderliggende bindweefsel wordt de oppervlakkige spierlaag snijden. Zorg ervoor dat u niet te gaan te diep, je wilt niet de heupzenuw of bloedvaten, of de spier van belang kunnen beschadigen. Begin over de gastrocnemius spier en snijd proximaal, langs dezelfde lijn als de huid incisie. Peek eronder te vinden en te voorkomen dat de heupzenuw. Zodra u de zenuw, kunt u de pad te volgen met uw incisie, maar blijf ruim boven de zenuw. Er is een duidelijke naad tussen muskelen. Plaats dit, en snijd langs die naad naar de knie. Kijk uit voor en vermijd bloedvaten. 4. Bereid piloot gat in femur voor bot-pin Knip de dunne laag van de spier over de caudale aspect van het dijbeen, het blootstellen van de kale bot. Met behulp van een hand-held draaiend gereedschap, boren, of pin ondeugd, (0,9 mm koolstofstaal bur), maak een klein gaatje door de cortex, en gewoon in de medulla. Boor niet te diep, of overmatig bloeden zal resulteren. Dit gat zal later worden gebruikt om een ​​bot pin plaatsen om de femur immobiliseren op de myograaf base. 5. Isoleer innervatie van de mediale gastrocnemius spier De volgende stap is een ontleedmicroscoop. Zoek de plaats waar de knieholte zenuw verdwijnt achter de mediale gastrocnemius spier. Voorzichtig verspreid de verschillende branches, en snijd alles wat niet innerveren de mediale gastrocnemius spier. Innervatie kan worden bepaald door microstimulatie. Op thiDe etappe, ook ervoor zorgen dat de oppervlakkige takken van de nervus ischiadicus worden gesneden. Nu ruimen het bindweefsel van de nervus ischiadicus, zodat het kan worden gleed in de zenuw manchet (later). Zorg ervoor dat u de zenuw voorzichtig te behandelen. Een stuk van de zenuw kan leiden tot inexcitability en voortijdig einde van uw experiment. 6. Isoleer de achillespees en gastrocnemius spier Stompe dissectie, waarbij af behulp van een schaar kan gebruikt worden om de gastrocnemiusspier scheiden van andere weefsels. De pees van de plantaris kan worden getrokken uit onder de achillespees, gebonden en gesneden. De band wordt alleen gebruikt om de pees te houden en kan worden weggesneden direct na de pees wordt gesneden en de plantaris wordt gescheiden van de gastrocnemius spier voor een aanzienlijke lengte. Plaats een # 1 zijde ligatuur rond de achillespees, en das met een platte knoop. Trek niet te strak, of de pees beschadigd worden. We maken gebruik van bot rongeurs aan de calcan snijden EUS, waardoor een klein stukje bot nog aan de achillespees. Houd de snijvlakken horizontale om er zeker van het bot is gesneden, niet alleen de pees. Dit zorgt ervoor dat de achillespees kan worden aangebracht later aan de myograaf. Langs de onderzijde van de gastrocnemius kan de soleus zichtbaar. Opnieuw kan stompe dissectie worden gebruikt om de soleus scheiden van de gastrocnemius spier. We willen de mediale gastrocnemius te isoleren, dus het is de enige spier nog aan de achillespees. Snij de soleus pees, dicht bij het distale einde. Dan kunt u scheiden van de mediale en laterale gastrocnemius spieren, en snijd de laterale pees, waardoor alleen de mediale gastrocnemius spier aan de achillespees. Trek de laterale gastrocnemius spieren buiten de mediale samen ongeveer 50% van zijn lengte. Dan deze lengte de vezels elkaar kruisen en schade door verder trekken. Controleer of de spier vrij is van bindweefsel. e "> 7. Snijd de tibia Plaats een ligatuur rond de schacht, net boven het midden. Dit moet strak, zonder te snijden in het weefsel. Een tweede lus voor koppelverkoop voorkomt uitglijden. Opnieuw gebruik maken van een platte knoop te beveiligen. Met behulp van een kleine zaag, snijd het onderbeen weg. Deze verlaging moet ongeveer halverwege langs het scheenbeen. Plaats een scherpe sonde in het merg van de tibia. Deze probe wordt gebruikt om de tibia op basis myograaf immobiliseren. Bevestig 2 elastieken de huid, met Michel clips. Deze en andere elastieken worden gebruikt om de huid houden rond de spier een container die wordt gevuld met paraffineolie verwarmde vormen. [OPTIONEEL] 8. Plaats sonometric kristallen (optionele stap) 5 Plaats het dier op een verwarmingselement bij lage stand. Een rectale sonde, kan indien deze niet reeds geplaatst ingevoegd op dit moment. Gebruik een kleine druppel paraffine-olie om te smeren. Met microstimulatie, identificeren de uiteinden van een fascicle binnen de spier. Steek een 21 gauge naald in de plaats van de oorsprong en insertie van de spier. Schuif een sonometric kristal in het gat van de naald, en afdichting met vet-band chirurgische lijm. Gebruik een kleine druppel lijm en zorg ervoor dat het goed wordt geplaatst over het kristal. Aanbrengen van de lijm op een stuk papier gesneden met scherpe hoeken helpt bij aanbrengen van de lijm nauwkeurig. We leggen een extra kristal bij het inbrengen van de fascicle die werd geïdentificeerd door microstimulatie. [CONTINUE] 9. Monteren inrichting (zie figuur 1) Plaats de rat op de myograaf basis, met het scheenbeen sonde gericht op de hendel. Plaats de sonde in de houder, het been immobiliseren. Trek de huid tot aan de zijkanten, een houder te vormen met elastieken verzekeren. Stel boor (1/16 inch) in de femur, waarbij de pilootgat dat is gemaakt tijdens chirurgische voorbereiding. Zorg ervoor dat u het dijbeen op het voorste gedeelte te ondersteunen als u de boor (in een pin vice) als breuk van het dijbeen kan leiden, beëindiging van het experiment voortijdig. Bevestig de pen bankschroef om een ​​cross-bar om het dijbeen te immobiliseren. Plaats de distale stomp van de nervus ischiadicus door de zenuw te stimuleren manchet (kathode in de richting van de spieren) en plooi terug dicht bij de oorsprong van de spier. Sluit de stimulator deze draden. Bevestig de Achillespees aan de hendel, die gevoelige sensoren op het heeft. Tie snuggly, maar laat enige ruimte voor later instellen. Zorg ervoor dat de uitlijning van de spier is loodrecht met de hendel. Vul het reservoir gevormd door de huid met warme paraffine-olie. Zet de warmtelamp en positie afschermingen van aluminiumfolie over de kop van het dier, en de krachtopnemer. Extra folie schilden kan noodzakelijk zijn om de kerntemperatuur van het dier niet exceed 38 ° C. De lengte van de spier kan worden ingesteld dat doorhangen van de tekenreeks wordt verwijderd uit de verbinding tussen de mediale gastrocnemius en de krachtopnemer. 10. Stel de maximale spanning en referentie lengte Terwijl de spier aan het opwarmen is, stelt u de stimulator en test de stimulatie spanning. Het is belangrijk om zeker de stimulatie ingesteld op zeer korte pulsduur. We maken gebruik van 50 microseconden. Maximale spanning moet minder dan 1 V vanaf 0,5 V, het voltage tot twitch amplitude niet toeneemt. Maximale spanning is de laagste spanning dat alle motorische eenheden activeert. We meestal stimuleren op het dubbele van de maximale spanning, of 3 V als dit hoger is. Typisch zal experimenten beginnen met de spieren aan de lengte die de grootste contractie twitch geeft. Een twitch wordt verkregen met een enkele stimulerende puls. De spierlengte wordt verhoogd met ongeveer 1 mm voor een twitch. Dit wordt herhaald zolang twitch amplitudetoeneemt. Zodra twitch amplitude afneemt zal de lengte worden teruggegeven aan degene die de grootste amplitude heeft twitch. Na deze eerste instelling van de lengte, testen we het systeem met wat we noemen een "conditionering tetanische contractie". De stimulator is ingesteld om pulsen te leveren bij 200 Hz voor 500 ms. Levering van deze stimulatie leidt tot een volledig gesmolten tetanische contractie. De kracht die door de spier draai alle verbindingen, met inbegrip van de knopen op de spier. Na een geschikte rust afvoer van potentiëring 4 wordt de verwijzing lengte van de spier wordt gereset (zie deel 9.2). Meestal is de conditionering tetanische contractie zullen sommige fascicle lengte korter zijn toegestaan, zodat de spier moet worden uitgerekt iets terug naar de lengte die de grootste amplitude twitch contractie geeft. 11. Start het experiment Een typisch experiment zal lengte verstellingent en / of stimulatie met verschillende patronen van de stimulatie. Het verzamelen van gegevens kan het gaan gewoon kracht, of kracht, met een lengte, fascicle lengte en elektromyogram. [OPTIONEEL] 12. Kracht-frequentie relatie 2 Stel de trein duur lang genoeg om een ​​plateau van kracht te bereiken bij een frequentie van belang. De maximale isometrische kracht bereikt in de mediale gastrocnemius bij 200 Hz. Trein duur ten minste 200 ms; langer is beter voor lagere frequenties, maar resulteert in sommige vermoeidheid wanneer meerdere contracties worden gebruikt om het volledige scala van de kracht-frequentie relatie te bepalen. We gebruiken meestal contracties bij 0, 20, 40, 60, 80, 100 en 200 Hz. Deze frequentiegebieden mogelijk het volledige bereik van de kracht-frequentie relatie te beschrijven. Een geschikte rust tussen contracties moet kunnen voorkomen vermoeidheid (1-10 min). 13. Kracht-lengte RELATIEip 6 De geschatte optimale lengte eerder, kan een kracht-lengte verhouding worden bepaald door het systematisch de lengte van de spier van -4 tot +4 mm mm met een servo-motor inrichting. Dit moet gebeuren met maximale stimulering (200 Hz), maar we hebben ontdekt dat zeer korte weeën hetzelfde geldt optimale lengte 7 verkregen. Submaximale contracties, zoals samentrekkingen, worden gebruikt, maar dit levert een andere lengte-afhankelijkheid van kracht 8. Een belangrijk aspect van de bepaling van de kracht-lengte relatie is de noodzaak om de passieve kracht schatten op de fascicle lengte waarbij de gemeten kracht optreedt. Actieve kracht wordt berekend als het verschil tussen totale kracht en de juiste passieve kracht. Aangezien de parallelle elastische structuren draagt ​​de passieve kracht en deze zijn in serie met de serie elastische structuren moeten de passieve kracht bijdrage aan totale kracht afnemen naarmate de reeks elastic structuren worden uitgerekt tijdens een wee 3. Zodra de passieve kracht is gekend voor alle relevante spierlengtes, kan de juiste passieve kracht worden geschat met de continue meting van fascicle lengte met behulp van sonomicrometry, of door het schatten van de naleving van het meetsysteem en de in-serie structuren van de spier-pees-eenheid. Als dit niet gebeurt, worden de optimale lengte van het preparaat en piek krachten, onderschat. 14. Kracht-snelheid relatie 9 Als u wilt de kracht-snelheid relatie vast te stellen, moet u de krachtomzetters hechten aan een systeem, waarop de controle van een van beide belasting of snelheid van lengteverandering mogelijk maakt. De eenvoudigste en meest kosteneffectieve methode is om de luchtdruk te gebruiken om verkorting te beperken tot een gecontroleerde lading. In ons systeem wordt de spier aan de hefboom aan een zijde van het draaipunt en de luchtdruk belemmert lengteverandering aan de andere kant. Een lengte sensor needs in dienst, zodat u in staat zijn om de verandering in spierlengte detecteren tijdens isotone contracties. Deze opstelling is afterloaded contracties met pneumatische weerstand. Dubbele tanks kunnen toestaan ​​isometrische contractie met lozing in een isotone belasting. In totaal van 15-20 contracties moet worden verkregen, met ladingen variërend van bijna onbelast tot maximale isometrische kracht. Bij de montage van gegevens een vergelijking moet lasten boven 90% van isometrische niet gebruiken 9. 15. Representatieve resultaten: Voorbeeld contracties zijn weergegeven in figuur 2. Deze contracties werden verkregen van de kracht-frequentierelatie illustreren. Het berekenen van de maximale actieve kracht van deze contracties, en het plotten van de actieve kracht tegen de frequentie, de opbrengst Figuur 3, de kracht-frequentie relatie. De gegevens in figuur 2 kunnen passen aan de vergelijking: AF = c / (1 + e ((AF) / b) + d) AF werkzame kracht F in frequentie en, b, c en d constanten zijn. Voor de rat mediale gastrocnemius spier, de half-maximale frequentie van stimulatie is gewoonlijk 50-60 Hz in niet-vermoeide spier 2. De resultaten zullen nauw aansluiten op de lijn die door de vergelijking hierboven. Figuur 1 Inrichting en spier set-up:. Pneumatische opstelling wordt getoond links isometrische rechts. Het hefsysteem links weergegeven is aan de omzettingstabel als dynamische contracties gewenst (naar 13). De stappenmotor wordt aangestuurd door een computer (naar 14). . Figuur 2 Gesuperponeerd isometrische contracties: 20, 40, 60, 80, 100 en 200 Hz. De amplitude van de contractie is 200 Hz 8,13 N. les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg "/> . Figuur 3 Kracht-frequentie relatie: Actieve kracht van de contracties in figuur 2 worden uitgezet en de lijn staat voor de best passende lijn.