Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

1. Introducción El laboratorio de Macintosh ha estado usando la preparación músculo gemelo medial durante varios años, y antes de eso, toda la preparación de los músculos gemelos, como el desarrollado con el Dr. Phil Gardiner 1. 2. Anestesia Adulto ratas Sprague-Dawley (200-300 g) se utilizan normalmente en nuestro laboratorio para el estudio de las propiedades contráctiles en el lugar. La rata se puede restringir en un dispositivo de plexiglás, disponibles en el mercado, o cubriendo con una toalla, y la celebración. Usamos la ketamina / xilazina, (100 mg · ml -1, cada uno) mezclados en 85:15, y administrar 0,1 ml por cada 100 g de peso del animal por vía intramuscular 2,3. Pentobarbital sódico (50 a 60 mg · kg -1, intraperiteneal) o isoflurano (2-3,5%, inhalada) también se puede utilizar 4. Mientras que la anestesia hace efecto, un peso exacto se puede obtener y se afeitó la izquierda los miembros traseros. Esto también es un buen momento para estar seguro de todos los aparatos electrónicos están encendidos y listos. Esto incluye ordenadores, un amplificador de calibrador de tensión, el calentador de aceite, entre otros. Compruebe si hay retorno de respuesta refleja periódicamente y complementar la anestesia cuando sea necesario (0,05 a 0,1 ml por cada 100 g). 3. Inicio de la cirugía Utilizamos una plataforma de plexiglás en la que para inmovilizar la rata para la cirugía. Cinta adhesiva simple hace el trabajo. Asegúrese de que el animal se extendía desde extremidad posterior izquierda de extremidad anterior derecha. Agregar una gota de lubricante para los ojos. Usamos aceite de parafina. De lo contrario, los ojos se secan con anestesia ketamina. Una lámpara de quirófano pequeña es útil. Éste emite calor suficiente como para ayudar a mantener al animal caliente. Por otra parte, una manta de calentamiento de agua se puede utilizar. Compruebe que reflejos de la córnea o del pie emergente están ausentes antes de proceder. Técnicas de esterilización no es necesaria, ya que este procedimiento es aguda. El animal no se recupere de la anestesia. Nosotros la eutanasia a la rata con anestesia sobredosis (0,2 ml, intracardíaca) cuando se ha terminado. La primera incisión es a través de la piel desde el talón hasta la columna vertebral. Nosotros usamos las tijeras, ya que la profundidad del corte puede ser controlada y las tijeras se utilizan para separar la piel de los tejidos subyacentes. Las ratas tienen una hemostasia excelente, así que el tiempo que evitar los grandes vasos sanguíneos, hemorragia será limitado. Mantenga las superficies expuestas cubiertas con solución salina isotónica una gasa empapada, siempre que sea posible. Después se separa la piel del tejido conectivo subyacente, la capa muscular superficial se corta. Asegúrese de no ir demasiado profundo, que no quieren dañar el nervio ciático o los vasos sanguíneos o el músculo de su interés. Comience por los músculos gemelos y el corte proximal, en la misma línea que la incisión de la piel. Por debajo de Peek para localizar y evitar el nervio ciático. Una vez que vea el nervio, puede seguir su camino con la incisión, pero se quedan muy por encima del nervio. Hay una unión clara entre los músculos. Localizar este, y corte en esa unión hacia la rodilla. Vigilar y evitar los vasos sanguíneos. 4. Prepare agujero piloto en el fémur para el pasador de hueso Corte a través de la delgada capa de músculo en la cara caudal del fémur, dejando al descubierto el hueso al descubierto. Usando una mano herramienta rotatoria, perforación, o viceversa, pines, (0,9 mm de acero al carbono fresa), haga un agujero piloto a pequeña escala a través de la corteza, y sólo en la médula. No perforar demasiado profundamente, o sangrado excesivo resultado. Este agujero se usará más adelante para colocar un pin para inmovilizar los huesos del fémur sobre la base de miografía. 5. Aislar a la inervación de los músculos gemelo interno El siguiente paso requiere un microscopio de disección. Busque el lugar donde el nervio poplíteo desaparece detrás del músculo gemelo interno. Suavemente hacia fuera las diversas ramas, y cortar todo lo que no inervan el músculo gemelo interno. Inervación puede ser determinada por microestimulación. En esta etapa, también asegúrese de que las ramas superficiales del nervio ciático se cortan. Ahora está claro que el tejido conectivo fuera del nervio ciático, por lo que puede ser deslizado en el manguito de los nervios (más tarde). Asegúrese de tratar el nervio con suavidad. Cualquier tramo del nervio puede llevar a inexcitabilidad, y al final de su experimento antes de tiempo. 6. Aislar el tendón de Aquiles y los músculos gemelos Disección roma, con la ayuda ocasional de unas tijeras, se puede utilizar para separar los músculos gemelos de otros tejidos. El tendón del plantar puede ser sacado de debajo del tendón de Aquiles, atadas y cortadas. El empate se utiliza simplemente para ayudar a sostener el tendón y se puede cortar inmediatamente después de que el tendón se corta y el plantar se separa de los músculos gemelos de una longitud considerable. Colocar una ligadura de seda # 1 alrededor del tendón de Aquiles, y corbata en un nudo cuadrado. No tire demasiado fuerte, o el tendón dañado. Nosotros utilizamos pinzas para cortar hueso calcáneo, dejandoción un pequeño pedazo de hueso todavía adherido al tendón de Aquiles. Mantenga las superficies de corte horizontal para asegurarse de que el hueso se corta, no sólo en el tendón. Esto asegura que el tendón de Aquiles puede ser colocada en el miografía más tarde. A lo largo de la parte inferior del gastrocnemio, el sóleo se puede ver. Una vez más, una disección roma se puede utilizar para separar el músculo sóleo de los músculos gemelos. Queremos aislar el gemelo interno, por lo que es el único músculo que todavía unido al tendón de Aquiles. Cortar el tendón del sóleo, cerca del extremo distal. Entonces usted puede separar los músculos gastrocnemio medial y lateral, y cortar el tendón lateral, dejando sólo el músculo gemelo interno unido al tendón de Aquiles. Tire del músculo gastrocnemio lateral lejos de la media, a lo largo de aproximadamente el 50% de su longitud. Más allá de esta longitud, las fibras se cruzan y el daño será el resultado de más tirón. Compruebe que el músculo es el tejido conectivo. 7. Cortar la tibia Colocar una ligadura alrededor del vástago, justo por encima del punto medio. Esto tiene que ser ajustada, sin cortar en el tejido. Un segundo bucle antes de atar ayuda a evitar los resbalones. Una vez más utilizar un nudo cuadrado de seguro. Con una sierra pequeña, cortar la pierna de distancia. Este corte debe ser a medio camino a lo largo de la tibia. Insertar una sonda aguda en la médula de la tibia. Esta sonda se utiliza para inmovilizar la tibia sobre la base de miografía. Adjuntar dos elásticos de la piel, utilizando clips de Michel. Elásticos Estos y otros serán utilizados para mantener la piel alrededor de los músculos para formar un recipiente que se llena con aceite de parafina caliente. [OPCIONAL] 8. Inserte cristales sonometric (paso opcional) 5 Colocar el animal sobre una almohadilla térmica en el nivel bajo. Una sonda rectal, si no se ha insertado se puede insertar en este momento. Use una pequeña gota de aceite de parafina para lubricar. Utilizando microestimulación, identificar los extremos de un fascículo en el músculo. Poke una aguja de calibre 21 en el sitio de el origen y la inserción del músculo. Deslice un cristal sonometric en el agujero hecho por la aguja, y sellar con pegamento veterinario de bonos quirúrgica. Use una pequeña gota de pegamento, asegurándose de que está situado justo sobre el cristal. Dar la cola a un pedazo de papel cortado con un ángulo agudo ayuda en la aplicación de la cola con precisión. Estamos colocando un cristal adicional en la inserción de los fascículos que fue identificado por microestimulación. [CONTINUAR] 9. Montaje en el aparato (ver Figura 1) Posición de la rata en la base de miografía, con la sonda tibial orientado hacia la palanca. Coloque la sonda en el soporte, para inmovilizar la pierna. Tire de la piel a los lados, para formar un recipiente y seguro con elásticos. Conjunto broca (1 / 16 de pulgada º) en el fémur, a través del orificio piloto que se creó durante la preparación quirúrgica. Asegúrese de que el apoyo del fémur en la parte anterior como se coloca la broca (en un tornillo pasador) la rotura del fémur puede dar lugar, terminando el experimento antes de tiempo. Fije el pasador de vice a una barra transversal para inmovilizar el fémur. Coloque el muñón distal del nervio ciático a través del manguito de los nervios estimulantes (cátodo hacia los músculos) y meter de nuevo cerca del origen del músculo. Conectar el estimulador de estos cables. Conecte el tendón de Aquiles de la palanca, que tiene sensores de presión del medidor en la misma. Empate cómodamente, pero deja un cierto margen de ajuste posterior. Asegúrese de que la alineación de los músculos es perpendicular a la palanca. Llene el recipiente formado por la piel con aceite de parafina caliente. Encender la lámpara de calor y escudos hechos de papel de aluminio puesto sobre la cabeza del animal, y el transductor de fuerza. Escudos de aluminio adicionales pueden ser necesarias para asegurar la temperatura del núcleo del animal no exceda de 38 ° C. La longitud del músculo puede ser ajustada hasta holgura de la cadena se retira de la conexión entre el gemelo interno y el transductor de fuerza. 10. Ajuste de tensión máxima y la longitud de referencia Mientras que el músculo se está calentando, configurar el estimulador y poner a prueba la tensión de la estimulación. Es importante asegurarse de que la estimulación se fija en la duración del pulso muy breve. Usamos 50 ms. Tensión máxima debe ser inferior a 1 V. A partir de 0,5 V, aumentar la tensión hasta que la amplitud de contracción no se incrementa. Tensión máxima es la más baja de voltaje que activa todas las unidades de motor. Por lo general estimulan el doble de la tensión máxima o 3 V que sea mayor. Por lo general, los experimentos se iniciará con el músculo en la longitud que da a la contracción de la mayor contracción. Una contracción se obtiene con un pulso único estimulante. La longitud del músculo se incrementa alrededor de 1 mm por otra de contracción. Esto se repite siempre y cuando la amplitud de movimiento es increacantar. Una vez que disminuye la amplitud de contracción, la longitud será devuelto a la que dio la mayor amplitud de contracción. Después de esta configuración inicial de longitud, prueba el sistema con lo que nos referimos como "contracción tetánica acondicionado". El estimulador se ajusta para proporcionar pulsos de 200 Hz para 500 ms. La entrega de este estímulo se traducirá en una contracción tetánica fusionado completamente. La fuerza generada por el músculo se apriete todas las conexiones, incluyendo los nudos en los músculos. Después de un descanso adecuado para la disipación de la potenciación 4, la longitud de referencia del músculo se pone a cero (véase la parte 9.2). Por lo general, la contracción tetánica acondicionado se han permitido algunas acortamiento fascículo, por lo que el músculo tiene que ser estirado un poco para volver a la longitud que le da mayor amplitud de la contracción nerviosa. 11. Iniciar el experimento Un experimento típico se incluyen ajuste de la longitud y / o la estimulación con una variedad de patrones de estimulación. La recolección de datos puede implicar simplemente la fuerza o la fuerza, con la longitud, la longitud fascículo y el electromiograma. [OPCIONAL] 12. Fuerza-frecuencia 2 Establecer la duración del tren el tiempo suficiente para llegar a una meseta de la fuerza en cualquier frecuencia de interés. La fuerza isométrica máxima se alcanza en el músculo gemelo interno de 200 Hz. Duración de los trenes deben ser de al menos 200 ms, ya es mejor para las frecuencias más bajas, pero se traducirá en algo de fatiga, si varias contracciones se utilizan para determinar la gama completa de la relación fuerza-frecuencia. Por lo general utilizan las contracciones a las 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 200 Hz.. Este rango de frecuencias permitirá a toda la gama de la relación fuerza-frecuencia que se describe. Un descanso adecuado entre las contracciones se debe permitir para evitar la fatiga (1-10 min). 13. Fuerza-talla 6 Con el tiempo estimado óptimo establecido anteriormente, la relación fuerza-longitud se puede determinar de forma sistemática el ajuste de la longitud del músculo de -4 a 4 mm mm usando un aparato de servo-motor. Esto se debe hacer uso de la estimulación máxima (200 Hz), pero hemos encontrado que las contracciones muy breve dará la misma longitud real óptimo 7. Contracciones submáximas, como tics, se puede utilizar, pero esto dará lugar a una diferente longitud de la dependencia de la fuerza 8. Un aspecto importante de la determinación de la relación fuerza-longitud es la necesidad de estimar la fuerza pasiva en la longitud fascículo en el que la fuerza medida se produce. Fuerza activa se calcula como la diferencia entre el total de la fuerza y ​​la fuerza pasiva apropiado. Dado que las estructuras elásticas paralelas tienen la fuerza pasiva y estos están en serie con las estructuras de serie elástica, la contribución de la fuerza pasiva de la fuerza total debe disminuir a medida que las estructuras de la serie elástica se estiran durante una contracción del 3. Una vez que la fuerza pasiva es conocido por todas las longitudes de los músculos correspondientes, la fuerza pasiva adecuada se puede estimar con la medición continua de la longitud de fascículos con sonomicrometría, o por la estimación del cumplimiento del sistema de medición y las estructuras en la serie de la unidad músculo-tendinosa. Si esto no se hace, la duración óptima de la preparación y las fuerzas de pico, están subestimados. 14. Relación fuerza-velocidad 9 Si desea determinar la relación fuerza-velocidad, tendrá que adjuntar los transductores de fuerza a un sistema, que permite el control de cualquiera de la carga o la tasa de cambio de longitud. El método más fácil y más rentable es el uso de la presión del aire para limitar el acortamiento de una carga controlada. En nuestro sistema, el músculo está unido a la palanca de un lado del punto de apoyo y la presión del aire impide el cambio de longitud en el otro lado. Un sensor de longitud debe ser empleado de manera que usted es capaz de detectar el cambio en la longitud muscular durante las contracciones isotónicas. Esta disposición permite contracciones afterloaded con resistencia neumática. Tanques de doble puede permitir la contracción isométrica con la liberación de una carga isotónica. Un total de 15 a 20 contracciones se deben obtener, con cargas que van desde cerca de descarga de la fuerza isométrica máxima. Al colocar los datos en una ecuación, las cargas por encima del 90% de los isométricos no debe ser utilizado 9. 15. Los resultados representativos: Contracciones de la muestra se presentan en la Figura 2. Estas contracciones se obtuvieron para ilustrar la relación fuerza-frecuencia. Cálculo de la fuerza máxima activa de estas contracciones, y el trazado de la fuerza activa de la frecuencia, el rendimiento de la figura 3, la relación fuerza-frecuencia. Los datos presentados en la Figura 2 puede estar en forma para la siguiente ecuación: AF = c / (1 + e ((AF) / b) + d), AF es la fuerza activa, F es la frecuencia y, b, c, yd son constantes. Para el músculo gemelo interno de ratas, la frecuencia media máxima de estimulación suele ser de 50-60 Hz no fatigados músculos 2. Los resultados se ajustan estrechamente a la línea descrita por la ecuación anterior. Figura 1 Aparato muscular y set-up:. Neumática de configuración se muestra a la izquierda, isométrica a la derecha. El sistema de palanca muestra a la izquierda se une a la tabla de traducción cuando las contracciones dinámicas son deseados (adaptado de 13). El motor paso a paso está controlado por un ordenador (adaptado de 14). . Figura 2 superpuestas contracciones isométricas: 20, 40, 60, 80, 100 y 200 Hz.. La amplitud de la contracción de 200 Hz es 8,13 N. . Figura 3 fuerza-frecuencia: la fuerza activa de las contracciones en la figura 2 se representan y la línea representa la recta de mejor ajuste.