Isolement et caractérisation de Hoechst ^Faible CD45 ^Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

1. Isolement du poumon Sacrifice souris adultes (8-10 semaines d'âge; 18-20 g; C57Bl6J) des souris avec une surdose d'isoflurane suivi par exsanguination utilisant une technique stérile. Profils varient légèrement entre les souches. Enlever chirurgicalement le diaphragme, d'ouvrir la cavité thoracique en coupant la cage thoracique latéralement de chaque côté de la souris. Rincer le sang des poumons en perfusant le ventricule droit du cœur doucement à l'aide de 3 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). Disséquer les lobes pulmonaires enlever la trachée les bronches et les grands et les placer dans une boîte de Pétri remplies de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS). Après la collecte des lobes pulmonaires tous les forceps sont utilisés pour placer le tissu sur le couvercle du plat. Tissu est ensuite hachée en petits morceaux à l'aide de scalpels jetables avec assez de liquide pour les garder humides, mais pas tant qu'elles flottent et se déplacent. Disséquer une patte arrière d'une des souris et d'isoler la moelle osseuse pour l'utiliser comme un contrôle pour régler la coloration flow cytométrie portes. Tache de la moelle osseuse (BM), comme décrit précédemment 1. 2. Préparation d'une suspension cellulaire unique des tissus pulmonaires Chaque poumon est digérée en utilisant un poids optimisé pour les tissus rapport en volume de 0,2 g: 5 ml de pré-chauffé à 0,2% Worthington type 2 collagénase (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissous dans du HBSS stérile. Le mélange est immergé dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min 2,3. Triturer échantillon bien digérer jusqu'au tissu pulmonaire s'écoule facilement par une pipette de 10ml (environ 10 répétitions). Incuber pendant 15 min supplémentaires à 37 ° C pour compléter le tissu digère et assure une suspension cellulaire plus uniforme unique. Diluer la suspension de cellules de poumon avec HBSS et triturer avec une pipette de 5 ml pour disperser des fragments de tissu résiduel. Filtrer la suspension cellulaire à l'aide d'une passoire pour enlever 70μM fragments de tissus non digérés. L'échantillon peut être divisé en multipltubes coniques e à ce point pour éviter la surcharge des cellules et une crépine de diminuer le temps. Pellet la suspension cellulaire pendant 10 min à 1500 rpm et décanter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire en douceur en utilisant la température ambiante RBC tampon de lyse (eBiosciences, San Diego, CA; # cat 00-4333-57) et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter un volume égal de HBSS pour inactiver le tampon de lyse et de filtrage de la suspension cellulaire à l'aide d'une passoire cellules 40μM pour enlever les débris et les agrégats cellulaires. Pipeter 10 ul de chaque échantillon à être colorées et de compter le nombre de cellules à la fois pour le poumon et les échantillons de BM en utilisant un hématimètre. Remarque: enregistrer le volume total des cellules. Pellet la suspension cellulaire unique de cellules pulmonaires par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min. Resuspendre deux poumons et les cellules BM au 1×10 6 cellules / ml dans préchauffé (37 ° C) DMEM + (milieu de Dulbecco modifié Eagle, élevée en glucose (Gibco, Carlsbad, CA; # cat 11965-092) contenant 2% de fœtus BoviNE sérum (FBS) et HEPES 10 mM. Préparer une solution stock de 1mg/ml de Hoechst 33342 colorant (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; # cat B2261) dans l'eau et stériliser par filtration 1,4. Le colorant Hoechst peuvent être stockées sous forme d'aliquots à -80 ° C. Ajouter Hoescht 33342 teinture à une concentration finale de 5μg/ml (une dilution 200x d'un stock 1mg/ml) à la suspension cellulaire unique. Mélanger délicatement les cellules par l'inversion et incuber à 37 ° C l'eau de bain pour exactement 90 minutes. 3. Coloration et préparation de la suspension cellulaire du poumon pour l'analyse de cytométrie en flux Après 90 minutes toutes les étapes avec les cellules des poumons tachés Hoechst doit être exécuté à 4 ° C ou sur la glace pour empêcher l'efflux de teinture. Pellet les cellules par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension les cellules dans tampon glacé coloration (PBS 2% de FBS). Resuspendre les cellules à une concentration ne dépassant pas 1×10 7 cellules / tube à l'aide de 300 600μl de PBS contenant 2S et HEPES 10 mM. Ajouter suffisamment ricanait CD45 (généralement 1:200 dilution du CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; # cat 559864) dans les poumons et les échantillons BM Incuber sur la glace pendant 10-15 minutes incluant un contrôle sans tache lors de la.. procédure expérimentale est utile de définir les portes d'analyse. Pellet cellules à 4 ° C pendant 5 min à 1500 rpm. Décanter le surnageant et les cellules remettre en suspension dans 500 pl de tampon de coloration glacée (PBS 2% de FBS). Transfert à prechilled tubes pression bouchon en polypropylène (Fisherbrand, Schaumburg, IL, chat N ° 14-956-1D). Ajouter l'iodure de propidium (PI, le stock 200μg/ml dans le PBS) pour les échantillons pour une concentration finale de 2μg/ml d'exclure les cellules mortes. PI doit être utilisé en combinaison avec le colorant Hoechst 33342 pour atteindre le bon profil de fluorescence lors de l'analyse par cytométrie en flux. Conserver les tubes sur la glace, abri de la lumière jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux. 4. Cytométrie en flux pour définir et isolerUne cellule souche du poumon mésenchymateuses (CSM poumons) Population utilisant colorant Hoechst Efflux pour détecter une population Side (SP) Ce test a des exigences instruments suivants: 488 nm et UV (350-355 nm) lasers 2 détecteurs sur le chemin de laser UV avec du bleu (450/65) et rouge (675/50) filtres. Le détecteur UV rouge doit avoir une sensibilité élevée pour le signal rouge. Cela peut être un problème avec les trieurs de cellules plus âgées. Unité de refroidissement pour maintenir l'échantillon à 5-10 ° C. Aligner les lasers et mis en place pour le tri des cellules selon le protocole du fabricant. Recueillir le rouge (axe x) et bleu (axe des y) en utilisant des signaux Hoechst une échelle linéaire. Ajustez les tensions tube photomultiplicateur de placer le pic G0/G1 en haut à droite du centre de la parcelle pour permettre l'affichage adéquate de la population côté arrière. Une partie de la phase S et l'ensemble du G2 du cycle cellulaire peut être hors-échelle sur la droite supérieure de la parcelle. Le SIG bleuenal est relativement lumineux tandis que le signal rouge est sombre. Typiques MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) les tensions sont 425 pour le bleu et 650 pour le rouge. Les cellules mortes sont déclenchées à l'aide de PI. La voie standard IP (excitation 488nm, émission 630 nm) peuvent être utilisés. Alternativement, le PI est aussi excité par le laser UV et la population de cellules mortes se trouve au large échelle sur le côté droit du côté de la population (SP) intrigue. Cela allège le besoin de compenser le signal PI de tout autres fluorochromes tels que le FITC et PE. La méthode originale Goodell a suivi les procédures dernière 5-7. Maintenir une pression différentielle relativement faible en cours d'analyse et de tri pour assurer la résolution de la population serrée côté. Le SP apparaît comme un bras latéral en dehors de la principale population de cellules du poumon. Cette population est appelée Hoechst faible. Le faible Hoechst / SP est analysé pour séparer les populations CD45 positifs et négatifs en utilisant un histogramme 2,3 (Figure 1). Après sélection et gating des Hoechst faible CD45 neg population pulmonaires MSC les cellules peuvent être recueillies par le tri soit comme une population mixte dans un tube ou des cellules individuelles pour isoler les clones dans une plaque de 96 puits 3. Pour la plaque de tri la déviation flux de tri est ajusté à 25% pour créer un flux de tri plus verticale que celle habituellement utilisée pour le tri des tubes. Viser le flux de tri en envoyant une impulsion sur le flux de test en haut à gauche puis en bas à droite des puits d'une plaque de 96 puits. Réglez le plan de la plaque trieuse logiciels de déposer le nombre souhaité de cellules dans chaque puits. Pour isoler des clones de cellules unique un seul poumon MSC est trié dans le puits d'une plaque de 96 puits dans 150μl de la culture médiatique (α-MEM additionné de SVF 20%). Après le tri supplémentaire de 100 ul une moyenne est ajoutée. 5. L'isolement, la culture et de caractérisation des poumons MSC et clones Culture et l'expansion de la population des poumons MSC mixtes et des clones de cellules unique à la suite de tri est identique en utilisant les conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 et de l'humidité> 95%). Les cellules sont admises à adhérer l'isolement pendant 16 heures suivantes. Media est remplacé toutes les 48 heures (α-MEM additionné de SVF 20%). Quand les cellules commencent à proliférer plus rapidement et atteindre entre 75-80% de confluence sont repiquées (figure 2). Les cellules sont rincées avec HBSS préchauffée et incubées avec 0,5% de trypsine / EDTA (Cellgro, Manassas, en Virginie, cat # 25-053-Cl) à 37 ° C pendant moins de 2 min. Les cellules sont surveillées en utilisant un champ inversé pour confirmer l'apparition d'une suspension cellulaire. Lung MSC sont ensuite divisées au ratio de 1:2 ou 1:3 en fonction du taux de prolifération actuelle de la culture. La capacité des poumons CSM à se différencier en lignées mésenchymateuses traditionnelle des ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes et de leur expression à la surface des cellules mésenchymateuses du acceptées marqueurs is évaluée pour chaque préparation cellulaire. L'analyse cytogénétique de bandes est également effectuée pour confirmer l'absence d'anomalies chromosomiques 2,3,8-11 brute. 6. Énumération des MSC pulmonaires en utilisant un dosage formant colonies (UFC-F) Diluer les cellules dans un milieu de MesenCult complet (Stem Cell Technologies, Vancouver, C.-B.) à une concentration finale de 1×10 6 cellules / ml. Effectuer des dilutions en série pour obtenir des concentrations finales dans un plat de 100mm de 6×10 4 cellules, 3×10 4 cellules, 1,5 x10 4 cellules et 0,75 x10 4 cellules dans 10 ml de médias. Les analyses sont effectuées en triple double ou pour chaque concentration de cellules et peut être adapté pour les petites surfaces. Cellules en culture pendant 10 jours dans des conditions standard. Le jour 10 cellules sont rincées avec du PBS et fixées avec du méthanol à 100% pendant 5 minutes à température ambiante. Détecter les colonies CFU-F par coloration avec 0,4% p / v de solution de coloration de Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluée 1:20 avec de l'eau déminéralisée. Laisser les échantillons sécher à l'air et de quantifier le nombre de colonies contenant plus de 25 cellules par colonie (Figure 3). 7. L'analyse des propriétés immunomodulatrices des CSM sur les poumons des cellules T-prolifération et l'apoptose 6.25×10 4 cellules par puits MSC pulmonaires sont étalées dans des plaques 96 puits et on laisse reposer deux pendant la nuit. Cellules CD4 + à partir de rates de récepteur des cellules T (TCR) de souris transgéniques, l'OT-II avec des cellules T qui reconnaissent l'ovalbumine 323-339 peptide, sont purifiés par appauvrissant CD8 +, CD19 +, CMH-II + et CD25 + avec une trieuse de cellules Miltenyi Automacs (Miltenyi, Auburn, CA). Cellules présentatrices d'antigènes (APC) sont isolés par tri positif du CMH-II + 12 cellules. APC sont fixés dans du paraformaldéhyde 4%, lavé 3 fois en PBS / EDTA 5% BSA/2mM, et chargé avec 0.5μg/ml ou 5 ug / mL OVA323 peptide. Simulés, la croissance arrêtée APC sont ajoutés à la MSC du poumon chez les plaques à 96 puits. Plus de 95 CD4 + 1×10% pur 5 cellules sont marquées avec 5 um carboxyfluorescéine ester succinimidyle (CFSE; Sigma, St.Louis MO) dans du PBS et incubées pendant 5 min dans le noir, lavé avec du PBS-BSA 5%, et ensuite ajouté à la APC et les cellules du poumon chez MSC DMEM 5% FBS médias. Les cellules sont ensuite incubées pendant 96 heures. Les cellules T sont ensuite colorées avec des anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) et analysés en utilisant un Miltenyi MacsQuant 7 cytomètre en flux de canal (Miltenyi, Aurburn, CA) et Flojo logiciel d'analyse (Treestar, Ashland, OR). La prolifération est mesurée comme la diminution de l'intensité moyenne de fluorescence CFSE par rapport à l'arrière-plan, les cellules T étiquetés avec CFSE et non exposés à l'APC (figure 4). T-cellules sont comptées à cette époque et la viabilité évaluée avec exclusion du bleu trypan. 8. Les résultats représentatifs: <p class="Jove_content"> L'analyse des flux Figure 1. Cytométrique et définition des MSC du poumon. Suspensions cellulaires simples de tissu pulmonaire digérer sont colorés avec Hoechst 33342 et analysées par cytométrie en flux pour détecter des différences dans A. diffusion vers l'avant (FSC) et le côté scatter (SSC) et B. Hoechst bleu et rouge de fluorescence. La présence d'une population de côté (SP) est visible dans la porte. Le Hoechst faible SP est ensuite analysé pour séparer les C. CD45 négative de la population de MSC du poumon. Le CD45 positive à négative des ratios de cancer du poumon SP sont généralement 70:30 / 60:40. Figure 2. Isolement et culture de MSC du poumon. Après la collecte du MSC poumon par tri cellulaire, les cellules sont étalées dans les plats de 30mm en utilisant α-MEM Supplémented avec du FBS à 20%. Une. Fraîchement cellules triées apparaissent petit, rond et lumineux. B. Après environ 2-3 semaines colonies avec un phénotype mésenchymateux devenu évident et la prolifération est plus évidente. Figure 3. Dénombrement des MSC par Colony Forming-Assay fibroblastes. Pulmonaires élargi MSC sont plaquées par le protocole décrit pour le dosage de CFU-F. A. Après 10 jours et les colonies Giemsa sont évidents. Colonies B. sont grandes et composé d'un quelques centaines de cellules. C. Les cellules présentent un phénotype mésenchymateux. A & B, barre d'échelle = 0,5 cm; barre d'échelle C = 0,14 cm. Figure 4. CFSE dosage basé T prolifération cellulaire. En l'absence de MSC pulmonaires et la présence de antigen cellules présentatrices d'(APC) + / – ovalbumine (OVA) CD40 des cellules T effectrices positifs démontrent une diminution de l'intensité CFSE qui indique la prolifération (cercle rouge). L'intensité de fluorescence CFSE de la membrane des lymphocytes T diminue avec chaque stoechiométrique soit la division cellulaire. avec chaque division. En présence de cancer du poumon MSC, APC + / – OVA, le CD40 des cellules T effectrices positifs démontrent aucun changement significatif dans l'intensité CFSE qui indique une absence de prolifération (cercle rouge).