Invriezen van embryo's door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

De algemene opzet van het experiment is te zien in Fig. 1. 1. Bereiding van het reagens Maak de basis medium (hier in gekend als PB1) in een 100 ml glazen fles volgens de volgende tabel hieronder: MW mM mg/100ml NaCl 58,4 136,98 800,0 KCl 74,6 2,68 20,0 KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0 Na 2 HPO 4 0.12 H 2 O 358,14 8,04 288,1 MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0 <td> Glucose 180,2 5,56 100,0 Na pyruvaat 110 0,33 3.6 CaCl 2, 2H 2 O 147 0.9 13,2 Penicilline G 6,0 (ongeveer) Maak de Ficoll-sucrose (FS) oplossing: Voeg de volgende chemicaliën tot 14 ml van de PB1 oplossing in een 50 ml buis. Ficoll 70 6,0 g Sucrose 3,424 g BSA 42,0 mg Mix Ficoll 70 en sucrose in PB1-oplossing en schud goed totdat volledig is opgelost. Na controle volledig oplossen hierboven, tel BSA op het oppervlak van de oplossing en bewaar deze op4 oC tot de BSA volledig is opgelost (> 4 uur of een nacht). Maak de equilibratie oplossing (EFS20) en de verglazing oplossing (EFS40) in een 50 ml buis: EFS20: 20% (v / v) ethyleenglycol, 24% (w / v) Ficoll, en 0,4 mol / L sucrose in PB1 met BSA EFS40: 40% (v / v) ethyleenglycol, 18% (w / v) Ficoll, en 0,3 mol / L * sucrose in PB1 met BSA * Voor embryo's uit de BALB / c of ICR-stam, verhogen de concentratie van sucrose tot 0,9 mol / L sucrose, omdat ze zijn gevoeliger voor 6 cryodamage. EFS20 oplossing EFS40 oplossing Ethyleen glycol 1 ml 2 ml FS-oplossing 4 ml 3 ml Steriliseer de oplossing door filtratie met behulp van een 0,45 pm filter. Maak aliquots in 5 ml polystyreen buizen en bewaren bij 4 ° C. Ze kunnen worden gebruikt voor ongeveer 6 maanden. Voorbereiding van de embryo ontdooien oplossing met 0,75 M sucrose (TS1) Los 7,7 g sucrose in PB1 (opgesteld in stap 1.1) en breng het totale volume tot 30 ml. Meng door zachtjes te schudden totdat sucrose volledig is opgelost. Voeg 90 mg van BSA op het oppervlak van de oplossing en laat het staan ​​totdat volledig is opgelost. Steriliseer de oplossing door filtratie. Aliquot en bewaar bij 4 ° C. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand. Opmerking: TS1 kan ook worden bereid uit commercieel beschikbare M2. Los 7,7 g sucrose in M2 en brengen het totale volume tot 30 ml. Meng door zachtjes te schudden totdat sucrose volledig is opgelost. Steriliseer de oplossing door filtratie. Aliquot en bewaar bij 4 oC. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand. TS2 (ontdooien oplossingmet 0,25 M sucrose): Verdun 10 ml TS1 met 20 ml volume van PB1 of M2, naargelang het geval. Aliquot en bewaar bij 4 ° C. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand. 2. Verglazing van 2-cel Mouse Embryo's Bereid 2-cell muis embryo's door natuurlijke dekking of conventionele in vitro fertilisatie technieken. Aliquot 50 ul EFS40 in een cryotube. Hierna, voert u de rest van de verglazing procedure bij de kamertemperatuur. Aliquot 50 ul van EFS20 op de bodem van een 35 mm of 60 mm plastic petrischaal. Overdracht tot 30 embryo's te EFS20 met behulp van een glazen capillair met alleen het minimumbedrag van het kweekmedium. Start een timer voor 2 minuten. Let op: Plaats embryo's aan de onderkant van de druppel. Dit maakt een efficiënte uitdroging van embryo's. Controleer de morfologie van embryo's door een stereomicroscoop. Gedehydrateerde embryo's laten een gekrompen morfologie, zoals getoond in Fig. 2A.Als ze niet uitgedroogd genoeg zijn, wachten op meer 1 of 2 minuten. Op ongeveer 1,5 min, pak de embryo's uit de EFS20 druppel met slechts het minimum van de oplossing. Overbrengen naar EFS40 in de cryotube bereid in stap 2.1. Opmerking: Voor de beste resultaten, de timing van het oppakken van embryo's zodat alle embryo's kunnen worden omgezet in EFS40 rond de 2 minuten. Wacht 1 minuut. Direct zet de cryotube in vloeibare stikstof (LN 2). 3. Ontdooien Verglaasd 2-cell muizenembryo's Voor ontdooien, bereiden een gerecht met 10 ul druppels embryo cultuur medium voor teruggewonnen embryo's (zie stap 3.13). Bedek de schotel met olie en plaats het in een CO 2 incubator tot gebruik. Opmerking: Hoewel alle media voor routine embryo cultuur kan worden gebruikt in dit experiment, raden we aan media met hogere osmolariteit zoals M16 medium. Warm TS1 tot 37 ° C. Doe een gezichtsmasker en cryogloves. Open de LN 2 tAnk en ophalen een cryotube met embryo's. Snel te openen de bovenkant van de buis en gooi LN 2. Wacht 30 seconden om te voorkomen dat TS1 tegen bevriezen de volgende stap. Gebruik een 1000ul pipet tot 850 ul van TS1 (37 ° C) toe te voegen in de buis en de oplossing te mengen door voorzichtig pipettings (ongeveer tien keer in 25 seconden) tot de oplossing gelijkmatig opgelost. Overdracht van het gehele volume van de buis om een plastic 60 mm petrischaal (of een horloge glas) (Fig. 3A). Let op: Embryo's moeten worden behandeld bij kamertemperatuur (22-25 ° C) tot ze worden geplaatst in een CO 2 incubator bij stap 3.14. Start een timer voor 3 minuten. Op ongeveer 2 min in TS1, schud de schotel tot de medium met embryo's is verdeeld over het oppervlak van de schotel (Fig. 3B). Opmerking: Dit zal helpen de embryo's naar beneden naar de bodem, omdat ze drijven aan de oppervlakte toen overgebracht naar TS1. Zet drie 50 ul druppels TS2 op ee schaal (fig. 3C). Na 3 minuten in TS1, controleer dan de morfologie van embryo's door een stereomicroscoop, ze moeten licht gekrompen. Zie de morfologie van embryo's in eerdere (Fig. 2B) en later (fig. 2C) in TS1. Opmerking: Als de embryo's zijn nog steeds gezwollen, bewaar ze in TS1 voor meer 1 tot 3 minuten. Pak de embryo's en overbrengen naar de eerste druppel van de TS2 (fig. 3D). Start een timer voor 3 min Na 3 minuten, transfer embryo's naar de tweede te laten vallen en dan naar de derde vervolgkeuzelijst (Fig. 3E). Overdracht van de embryo's aan het kweekmedium bereid bij stap 3.1. De embryo's worden in de vorm getoond in Fig. 2D. Plaats schotel in een CO 2 incubator. Ongeveer 10 min later, transfer embryo's naar de volgende druppel kweekmedium uit te spoelen sucrose die zijn overgedragen van TS2. Ga verder cultuur in een CO2-incubator tot embryo transfer. Let op: Transfer Embryos van de eileiders van de ontvanger vrouwen op de dag van ontdooien. Lang cultuur in vitro kan verminderen de levensvatbaarheid van embryo's in sommige stammen van muizen. 4. Representatieve resultaten: In vitro – en in vivo-ontwikkeling van embryo's na ontdooien wordt gepresenteerd in de tabellen 1 en 2. De voordelen van dit protocol zijn de hoge overlevingskansen van embryo's na ontdooien en zijn brede toepasbaarheid op verschillende stammen van muizen. Spanning Totaal aantal buizen Aantal verglaasde embryo's Voor het terugwinnen (Aantal (%)) Morfologisch normaal (Aantal (%)) Ontwikkeling tot blastocysten (Aantal (%)) C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87) BALB / cA 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84) ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90) Tabel 1. In vitro-ontwikkeling van verglaasd-ontdooide embryo's met elkaar gemeen muizenstammen Toestand van embryo's Nee van de ontvanger vrouwen Aantal embryo's Implantatie sites (Aantal (%)) Levende nakomelingen (Aantal (%)) Fris 12 180 141 (78.3) 110 (61.1) Verglaasd 16 242 202 (83.5) 125 (51.7) Tabel 2. In vivo-ontwikkeling van verglaasd-ontdooide embryo's in C57BL/6J muizen. Figuur 1. De algemene regeling van het experiment met inbegrip van verevening, verglazing en ontdooien van embryo's. Figuur 2. De morfologie van embryo's bij elke stap van het ontdooien. Figuur 3. Ontdooien van embryo's. Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. (A), voeg 850 ul van TS1 (37 ° C) in een cryotube en overdracht van de gehele volume van de oplossing in de cryotube op een plastic schaaltje. Op dit moment kijken de embryo's gezwollen zoals getoond in Fig. 2B. (B), Verdeel de oplossing over het oppervlak van de schotel door zachtjes te schudden. (C), Place drie 50 pl druppels TS2 op de plastic schotel. (D), transfer de embryo's om de eerste daling van de TS2. Na 3 min, de embryo's kijk shurunken zoals getoond in Fig. 2C. (E), over te dragen seriëlely in de rest van TS2 daalt en vervolgens aan het kweekmedium.