Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Il nostro protocollo inizia con un metodo di adattarsi a culture umane iPSCs alimentatore-libera, seguito da protocolli per trasfezione iPSCs umani utilizzando GeneJuice (EMD) e nucleofection di iPSCs umani utilizzando un dispositivo di Amaxa nuclefector. Nota: Le seguenti procedure sono eseguite in una cappa a flusso laminare sterile. Tutti i mezzi e le soluzioni sono equilibrati a 37 ° C oa temperatura ambiente prima di iniziare se non diversamente specificato. 1. Stabilire iPSCs umani sul sistema privo di alimentatore IPSCs umani precedentemente detenute nelle cellule di alimentazione possono essere divisi, trasferiti su Geltrex rivestite piatto e mantenuta per due passaggi prima di alimentazione priva di trasfezione. Scongelare Geltrex notte a 4 ° C. Per preparare rivestimento Geltrex, diluire scongelato Geltrex 1:50 in DMEM freddo. Mescolare delicatamente le soluzioni. Nota: Geltrex, come Matrigel è una forma solubile di matr membrana basaleix purificati da murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) cellule tumorali. In alternativa, Matrigel può essere utilizzato come matrice extracellulare stabilire culture umane alimentatore-libere IPSC. Coprire l'intera superficie dei pozzetti di coltura con Geltrex soluzione (1 ml per 35 mm oltre). Cappotto pozzetti con Geltrex a 37 ° C incubatore per 1 ora. Per iPSCs passaggio umano, aggiungere 1 ml di accutase per pozzetto e incubare a 37 ° C per 1 minuto fino a quando la maggior parte delle cellule iniziano a staccarsi. Per iPSCs passaggio umano, aggiungere 1 ml di accutase per pozzetto e incubare a 37 ° C per 1 minuto fino a quando la maggior parte delle cellule iniziano a staccarsi. Aggiungere 10-15 perle di vetro per le cellule e mescolare delicatamente la piastra. Aggiungere 2 ml di DMEM KnockOut / F12 e delicatamente triturare. Trasferire sospensione cellulare in un tubo da centrifuga da 10 ml. Centrifugare le cellule a 800 rpm per 3 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante dal tubo, lasciando intatta umana iPSC pellet. Delicatamente scatti la provetta perdisperdere pellet. Rimuovere Geltrex dal pozzo rivestito. Risospendere delicatamente umano iPSC pellet in un volume adeguato di STEMPRO. Distribuire tra i pozzetti di alimentatori, a seconda del tasso di proliferazione). IPSCs umani possono essere diversi passaggi in un rapporto di divisione compreso tra 1:2 e 1:6. Con cautela in luogo del 5% CO 2 incubatore, agitare la piastra con attenzione per garantire una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il pozzetto. Le cellule di alimentazione tutti i giorni fino cellule sono pronte per essere dividere di nuovo (quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza). IPSCs passaggio umano sul nuovo pozzo Geltrex rivestita passo (1,3-1,9) in un rapporto di divisione di 1:2. Piccole colonie dovrebbero essere formati e distribuiti uniformemente su Geltrex rivestita bene prima trasfezione. 2. La trasfezione di iPSCs umani con GeneJuice (Cellule coltivate in piastre da 6 pozzetti) deve essere di circa 40 -50% confluenti nel giorno della trasfezione per ottenere un rendimento ottimale trasfezione. Ènon occorre modificare il mezzo cella fino al giorno successivo. Preparare 100 KO-DMEM/F12 ul in un tubo sterile 1,5 ml Eppendorf. Aggiungere 27 microlitri di reagente di trasfezione GeneJuice. Mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 4 mg DNA plasmidico. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 15 minuti. La scelta del plasmide è critico per l'efficienza di trasfezione ottimale. Usiamo un plasmide con una proteina maggiore fluorescenza verde (EGFP) guidato da CAG promotore 5 (pCAG-eGFP). CAG promotore è un promotore forte che è trascrizionalmente attivo in iPSCs umani e quindi può essere usato per guidare l'espressione del transgene in queste cellule. Nelle nostre mani, linearizzazione del plasmide non sembra influenzare l'efficienza di trasfezione. Aggiungi GeneJuice-DNA miscela alle cellule e agitare la piastra. Centrifugare la piastra a 1200 rpm per 5 minuti (metodo 'spinoculation') per aumentare il contatto della miscela di trasfezione con iPSCs umani sul pozzo. Incubare le cellule a 37 &deg; C per una notte. Monitorare l'efficienza di trasfezione il giorno successivo. Per la trasfezione stabile, modificare media il giorno successivo con STEMPRO fresco. Aggiungere appropriata selezione antibiotica dopo 24 – 48 ore. 3. Nucleofection di iPSCs umani IPSCs umani cresciuti su alimentatori o Geltrex può essere utilizzato per nucleofection. Tuttavia, si consiglia vivamente di replating nucleofected iPSCs umani su fibroblasti embrionali di topo (MEF) o fibroblasti prepuzio umano (HFF) alimentatori per garantire alta vitalità cellulare e di recupero. Almeno 2 milioni di cellule devono essere utilizzati per ottenere la sopravvivenza delle cellule superiore a seguito nucleofection. Preparare alimentatore cellule mezzi condizionati (CM) incubando umana KnockOut iPSC sierici di ricambio (KOSR) supporto con cellule di alimentazione durante la notte. Raccogliere CM ogni 24 ore. Nota: Qualsiasi ceppo di topi utilizzati per la preparazione di strati alimentatore (come BLK6, CF1 e MF1) è adatto per essere utilizzato for rendendo CM. Il giorno della nucleofection, pre-trattare iPSCs umani con 10 pM ROCK inibitore per almeno 1 ora. Preparare 82 ml di soluzione umana Nucleofector cellule staminali in una sterile 1,5 ml tubo eppendorf. Aggiungere 18 microlitri supplemento 1. Mescolare bene. Incubare la soluzione a 37 ° C per 5 minuti. Preriscaldare alimentatore cella condizionata media (CM) e 0,25% tripsina / EDTA a 37 ° C. Sotto il cofano, prelabel uno sterile da 15 ml tubo conico. Rimuovere con cautela i supporti dal cultura umana iPSC da nucleofected. Lavare delicatamente le cellule con 2 ml di soluzione di fosfato 1X tamponata (PBS) per pozzetto. Aspirare il PBS. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina per pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C per 3 minuti. Delicatamente triturare le cellule con 1000 ml di punta della pipetta. Lavare il fondo del pozzo per assicurarsi che tutti iPSCs umani sono completamente staccato. Trasferire sospensione cellulare alla provetta etichettata 15 ml. Nota: tripsinizzazione in singolo cells va rigorosamente evitato. Le cellule devono essere sloggiato in piccoli ciuffi di cellule composto da circa triplette di cellule. Piccoli ciuffi di cellule (cellule triple) sarà dissociato in singole cellule durante la successiva manipolazione delle cellule. Aggiungere 9 ml supporti MEF per inattivare la tripsina. Spin le cellule a 800 rpm per 3 minuti. Aspirare accuratamente il supernatante e lasciare il pellet di cellule intatte. Risospendere le cellule in preriscaldato 100 ul di soluzione di cellule staminali umane Nucleofector dal punto 3.3. Trasferire le cellule a una cuvetta Nucleofector utilizzando un ml 1 puntale. Aggiungere 4 pg di DNA plasmidico in sospensione di cellule nella cuvetta. Mescolare cellule e il DNA agitando delicatamente. Toccare la cuvetta due volte sulla superficie del cofano. Inserire la cuvetta nel porta Nucleofector. Utilizzare programmi B-016. Cellule Nucleofect premendo il pulsante X. < > Verrà visualizzato quando il processo nucleofection è completed (di solito richiede solo 1-5 secondi). L'uso di altri programmi nucleofection (A-023, A-033 e U-023) prodotto meno del 10% di cellule positive eGFP da iPSCs umane. Recuperare le cellule nucleofected dalla cuvetta utilizzando l'apposita pipetta Pasteur di plastica. Recuperare le cellule da risospensione in CM preriscaldato e inibitore ROCK in una sterile 1,5 ml tubo eppendorf. Incubare le cellule a 37 ° C per 10 minuti per far recuperare cellule. Cellule di trasferimento goccia a goccia su strati alimentazione con 1 ml punta della pipetta. Incubare le cellule a 37 ° C per una notte. Monitorare l'efficienza di trasfezione il giorno successivo. Per derivare cloni stabili di transgenici iPSCs umani che esprimono stabilmente transgene, cambiare mezzo il giorno dopo con CM e inibitore ROCK. Aggiungere appropriata selezione antibiotica dopo 24 – 48 ore. 4. Rappresentante dei risultati: <strong> Figura 1. Microfotografie di Riv1 iPSCs umane trasfettate con pCAG-eGFP. (A) eGFP-esprimenti Riv1 cellule trasfettate con il GeneJuice Geltrex 12 ore dopo la trasfezione. Le colonie di Riv1 iPSCs umani placcato e formato su linee seguenti nucleofection con B-016 (B) e A-023 (C) del programma. (D) che esprimono stabilmente eGFP-colonie umane IPSC con espressione eGFP ubiquitaria derivato da GeneJuice. (E) stabilmente transfettate Riv1 iPSCs umani conservati espressione costitutiva eGFP durante il differenziamento del corpo embryoid.