Kartläggning Hämmande neuronala kretsar av Laser Scanning fotostimulering
Summary
Denna uppsats presenterar en metod att kombinera laserskanning fotostimulering med hela celler inspelningar i transgena möss som uttrycker GFP i begränsade hämmande neuron populationer. Tekniken möjliggör omfattande kartläggning och kvantitativ analys av de lokala synaptiska kretsar av specifika hämmande kortikala neuroner.
Abstract
Hämmande nervceller är avgörande för kortikalt funktion. De utgör omkring 20% av hela den kortikala neuronala populationen och kan indelas ytterligare i olika subtyper baserat på deras immunokemiska morfologiska och fysiologiska egenskaper 1-4. Även tidigare forskning har visat mycket om inneboende egenskaper hos enskilda typer av hämmande nervceller är kunskap om de lokala kretsanslutningar fortfarande relativt begränsad 3,5,6. Med tanke på att varje enskild neuron funktion formas av dess retande och hämmande synaptiska ingång inom kortikala kretsar, har vi använt laserskanning fotostimulering (LSP) att kartlägga lokala krets anslutningar till specifika hämmande celltyper. Jämfört med konventionell elektrisk stimulering eller glutamat puff stimulering, har LSP unika fördelar som möjliggör omfattande kartläggning och kvantitativ analys av de lokala funktionella ingångar till individuellt inspelad nervceller 3,7-9. Laser fotostimulering via glutamat uncaging aktiverar selektivt nervceller perisomatically, utan att aktivera axoner av passagen eller distala dendriter, vilket garanterar en sub-laminär kartläggning upplösning. Känsligheten och effektivitet LSP för kartläggning input från många stimulering platser över ett stort område är väl lämpade för kortikal krets analys.
Här presenterar vi tekniken för LSP kombination med helcells-lapp fastspänning för lokal hämmande krets kartläggning. Riktade inspelningar av specifika hämmande celltyper underlättas genom användning av transgena möss som uttrycker grönt fluorescerande proteiner (GFP) i begränsade hämmande neuron populationer i cortex 3,10, vilket möjliggör konsekvent urval av de riktade celltyper och otvetydig identifiering av de registrerade celltyper . När det gäller LSP kartläggning, beskriva vi systemet instrumentering, beskriva den experimentella förfarandet och datainsamling och presentera exempel på kretsens kartläggning i mus primär somatosensory cortex. Såsom illustreras i våra experiment, är caged glutamat aktiveras i ett rumsligt begränsat område av hjärnan skiva genom UV-laser fotolys, samtidiga spännings-clamp inspelningar möjliggöra detektering av fotostimulering framkallade synaptiska svar. Kartor av antingen excitatoriska eller inhiberande synaptisk inmatning till riktade neuronen genereras genom avsökning av laserstrålen att stimulera hundratals potentiella presynaptiska platser. Således kan LSP byggandet av detaljerade kartor över synaptiska ingångar infaller på specifika typer av hämmande nervceller genom upprepade experiment. Sammantaget erbjuder fotostimulering-baserad teknik neuroforskare ett kraftfullt verktyg för att bestämma den funktionella organisation av lokala kortikala kretsar.
Protocol
Discussion
Fotostimulering-baserade kartläggning tekniker har faktiskt tillämpas för att analysera kortikala kretsar. Laserskanning fotostimulering kombination med helcells inspelning tillåter hög upplösning kartläggning av laminära fördelningar av presynaptiska ingångskällor till enskilda neuroner, eftersom samtidig inspelning från en postsynaptisk neuron med fotostimulering av kluster av presynaptiska neuron vid många olika platser ger kvantitativa mått på rumsliga fördelningen av excitatoriska eller hämmande in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin för deras hjälp. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag DA023700 och DA023700-04S1 till XX
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) |
Solutions:
- Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3).
- Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose)
- Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).
References
- Ascoli, G. A. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature. 9, 557-568 (2008).
- Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nature. 5, 793-807 (2004).
- Xu, X., Callaway, E. M. Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons. J Neurosci. 29, 70-85 (2009).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
- Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex. Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).
- Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation. J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin. J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).
- Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction. PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Cardin, J. A. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459, 663-667 (2009).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).
