מיפוי מעגלים עצביים מעכבים ידי Photostimulation סריקת הליזר
Summary
נייר זה מציג את גישה של שילוב סריקת הליזר photostimulation עם הקלטות תא שלמות בעכברים מהונדסים המבטאים GFP באוכלוסיות נוירון מעכבות מוגבלות. הטכניקה מאפשרת מיפוי מקיף וניתוח כמותי של מעגלים סינפטיים המקומיים של נוירונים בקליפת המוח מעכבים ספציפיים.
Abstract
הנוירונים מעכבים הם קריטיים לתפקוד של קליפת מוח. הם מהווים כ 20% מהאוכלוסייה העצבית בקליפת המוח כולו וניתן לסווג נוסף לתוך תת מגוונים המבוסס על immunochemical, הצורני שלהם, והתכונות פיסיולוגיות 1-4. למרות שמחקרים קודמים גילו הרבה על תכונות פנימיות של סוגים שונים של תאי עצב מעכבים, ידע על קשרי המעגלים המקומיים שלהם הוא עדיין מצומצם יחסית 3,5,6. בהתחשב בכך שהפונקציה של כל נוירון בודד מעוצבת על ידי הקלט המעורר והמעכב הסינפטית בתוך מעגלי קליפת מוח, היינו באמצעות ליזר סריקת photostimulation (LSPS) לחיבורים במעגל מקומיים המפה לסוגי תאים מעכבים ספציפיים. בהשוואה לגירוי חשמלי קונבנציונלי או גירוי עלים גלוטמט, LSPS יש יתרונות ייחודיים המאפשרים מיפוי מקיף וניתוח כמותי של תשומות פונקציונליות מקומיות לנוירונים 3,7-9 נרשמו בנפרד. ליזר תמונהגירוי באמצעות משחרר רפרוף גלוטמט סלקטיבי מפעיל נוירונים perisomatically, ללא הפעלת האקסונים של מעבר או דנדריטים הדיסטליים, אשר מבטיח רזולוצית מיפוי תת מינרית. הרגישות והיעילות של LSPS לתשומות מיפוי מאתרי גירוי רבים על פני אזור גדול מתאימות גם לניתוח מעגל קליפת מוח.
כאן אנו מציגים טכניקה של LSPS שילוב עם תיקון כל תאי clamping למיפוי מעגל מעכב מקומי. הקלטות ממוקדות של סוגי תאים מעכבים ספציפיים בהנחייתם של שימוש בעכברים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון ירוקים (GFP) באוכלוסיות נוירון מעכבות מוגבלות בקליפת 3,10, המאפשרת דגימה עקבית של סוגי התאים הממוקדים וזיהוי חד משמעי של סוגי התאים נרשמו . באשר למיפוי LSPS, אנו מתארים את מכשור המערכת, לתאר את הליך הניסוי ורכישת נתונים, ודוגמאות נוכחיות של מיפוי מעגל בעכבר העיקרי somatosensory קליפת המוח. כפי שהודגם בניסויים שלנו, גלוטמט כלוב מופעל באזור מרחב מוגבל של פרוסת המוח על ידי photolysis הליזר UV; הקלטות בו זמנית מתח מהדק לאפשר זיהוי של תגובות הסינפטי photostimulation-עוררו. מפות של קלט הסינפטי או מעכב או מעורר לנוירון הממוקד נוצרות על ידי סריקת קרן הליזר כדי לעורר מאה אתרים presynaptic פוטנציאליים. לפיכך, LSPS מאפשר הבנייה של מפות מפורטות של תשומות סינפטיים impinging על סוגים מסוימים של נוירונים מעכבים באמצעות ניסויים חוזרים ונשנים. יחדיו, הטכניקה photostimulation המבוססת מציעה מדעני המוח כלי רב עצמה לקביעת הארגון הפונקציונלי של מעגלי קליפת מוח המקומיים.
Protocol
Discussion
טכניקות מיפוי Photostimulation מבוססות כבר מיושם ביעילות לניתוח מעגלים בקליפת מוח. photostimulation סריקת הליזר בשילוב עם הקלטת תא שלמה מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוה של הפצות עלעלים של מקורות קלט presynaptic לנוירונים בודדים, כי ההקלטה סימולטנית מנוירון postsynaptic עם photostimulation של צבירי נוירונ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים טראן הוין, אנדרו סן אנטוניו, ג'רי לין לסיוע הטכני שלהם. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי DA023700 וDA023700-04S1 לXX
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) |
Solutions:
- Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3).
- Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose)
- Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).
References
- Ascoli, G. A. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature. 9, 557-568 (2008).
- Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nature. 5, 793-807 (2004).
- Xu, X., Callaway, E. M. Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons. J Neurosci. 29, 70-85 (2009).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
- Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex. Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).
- Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation. J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin. J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).
- Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction. PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Cardin, J. A. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459, 663-667 (2009).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).
