رسم الدوائر العصبية المثبطة بواسطة المسح الضوئي ليزر ضوئي
Summary
تقدم هذه الورقة مقاربة الجمع بين المسح الضوئي ليزر ضوئي مع تسجيلات خلية كاملة في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن GFP في الخلايا العصبية المثبطة محدودة السكان. هذه التقنية تسمح لرسم الخرائط والتحليل الكمي واسعة النطاق للدوائر المحلية متشابك من الخلايا العصبية المثبطة محددة القشرية.
Abstract
الخلايا العصبية المثبطة وظيفة ذات أهمية حاسمة لالقشرية. انهم يشكلون حوالي 20٪ من مجموع السكان العصبية القشرية، ويمكن تقسيمها إلى مزيد من الأنواع الفرعية المختلفة على أساس المورفولوجية الخاصة بهم، مناعى، والخصائص الفسيولوجية 1-4. على الرغم من أن الأبحاث السابقة كشفت الكثير عن الخصائص الذاتية للفرد من أنواع الخلايا العصبية المثبطة والمعرفة عن صلاتهم الدوائر المحلية لا تزال محدودة نسبيا 3،5،6. بالنظر إلى أن تتشكل وظيفة كل عصبون المرء عن طريق مساهمتها متشابك مثير والمثبطة داخل الدوائر القشرية، لقد تم مسح ضوئي باستخدام الليزر (LSPS) لاتصالات خريطة الدوائر المحلية لأنواع الخلايا المثبطة محددة. مقارنة التحفيز الكهربائي التقليدية أو الغلوتامات التحفيز نفخة، LSPS لديه مزايا فريدة تسمح لرسم الخرائط والتحليل الكمي واسعة من المدخلات الفنية المحلية على الخلايا العصبية بشكل فردي سجلت 3،7-9. الليزر الصورةالتحفيز عن طريق uncaging الغلوتامات ينشط الخلايا العصبية بشكل انتقائي perisomatically، دون تفعيل محاور عصبية من التشعبات أو مرور البعيدة، والتي تضمن قرار التعيين الفرعية الصفحي. هي مناسبة تماما لحساسية وكفاءة المدخلات لرسم الخرائط LSPS من مواقع عديدة على مدى التحفيز منطقة كبيرة لتحليل الدوائر القشرية.
هنا نقدم أسلوب LSPS جنبا إلى جنب مع خلية كاملة التصحيح للقط المحلية رسم خرائط الدوائر المثبطة. ومما يسهل من التسجيلات استهدفت أنواع الخلايا المثبطة محددة عن طريق استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) في الخلايا العصبية المثبطة محدودة السكان في القشرة 3،10، والتي تمكن من أخذ عينات تتفق أنواع الخلايا المستهدفة وتحديد واضح للأنواع الخلايا سجلت . أما بالنسبة لرسم الخرائط LSPS، ونحن الخطوط العريضة لنظام الأجهزة، ووصف الإجراء التجريبي والحصول على البيانات، وتقديم أمثلة على رسم خرائط الدوائر الابتدائية في الماوس somatosensory القشرة. كما هو موضح في تجاربنا، يتم تنشيط الغلوتامات في قفص في منطقة محدودة مكانيا من شريحة الدماغ عن طريق التحلل الضوئي ليزر الأشعة فوق البنفسجية؛ متزامنة الجهد المشبك التسجيلات تسمح كشف ضوئي-استجابات متشابك. يتم إنشاء خرائط لمدخلات متشابك مثير أو المثبطة إما إلى الخلايا العصبية المستهدفة عن طريق المسح الضوئي شعاع الليزر لتحفيز مئات المواقع المحتملة قبل المشبكي. وهكذا، يمكن LSPS بناء خرائط تفصيلية للمدخلات متشابك تؤثر على أنواع معينة من الخلايا العصبية المثبطة من خلال التجارب المتكررة. أخذت معا، هذه التقنية على أساس ضوئي يقدم علماء الأعصاب أداة قوية لتحديد التنظيم الوظيفي للدوائر المحلية القشرية.
Protocol
Discussion
وقد تم تعيين ضوئي تقنيات القائمة على التطبيق الفعال لتحليل الدوائر القشرية. ليزر ضوئي مسح جنبا إلى جنب مع تسجيل خلية كاملة يسمح رسم الخرائط عالية القرار من توزيعات الصفحي من مصادر إدخال الخلايا العصبية قبل المشبكي إلى واحد، وذلك لأن وقت واحد تسجيل من الخلايا العصبية…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تران هيونه، أندرو سان أنطونيو، لين جيري للحصول على المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DA023700 وDA023700-04S1 إلى XX
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) |
Solutions:
- Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3).
- Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose)
- Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).
References
- Ascoli, G. A. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature. 9, 557-568 (2008).
- Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nature. 5, 793-807 (2004).
- Xu, X., Callaway, E. M. Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons. J Neurosci. 29, 70-85 (2009).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
- Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex. Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).
- Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation. J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin. J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).
- Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction. PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Cardin, J. A. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459, 663-667 (2009).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).
