植物の葉におけるヒストン修飾の検出

1。植物材料の架橋 50 mlのプラスチックチューブで収穫シロイヌナズナの葉の1〜2グラム（6〜10cmのロゼットの直径）と架橋のバッファと40mlのためにいっぱいに。 葉は右側のバッファの表面上に合わせたフィルタースポンジを詰めることによって、例えば、浸漬滞在を確認してください。その後、デシケーター中にチューブを置きます。 真空は、10分間浸潤。各チューブに架橋を停止するには2Mグリシンの2.5mLを追加し、そしてグリシンの均等分散を保証するためにチューブを反転させる。 真空は、別の5分間に潜入し、ふるいに葉を収穫しながら液を捨てる。 洗浄は、ガラスのビーカーの水の1L、徹底的にペーパータオルで乾燥した葉で二回葉。 新鮮なプラスチック製のチューブで葉を収集し、液体窒素中で凍結する。店は-80葉° Cまでのクロマチンの単離。 2。クロマチンの単離葉は、使用するまで液体窒素中に保管されたモルタルと雌しべで粉砕した。 を50 mLプラスティックチューブに粉を移し、30mLを抽出バッファー＃1で一時停止。 オーバーヘッドシェーカー上で4℃で15分間インキュベートする。 新鮮な50 mLのプラスチックチューブにミラクロスの4つの層を介してろ液は、懸濁液。 4℃で2800 × gで20分のためにスピン℃に上清を除去し、1mLの抽出バッファー＃2のペイントブラシでペレットを懸濁する。まず、ペイントブラシでペレットを中断し、バッファの残りを追加し、バッファ＃2の小さなボリュームを追加します。 4℃で12,000 xgで10分間1.5mlのマイクロチューブとスピンして懸濁液を移す℃に一方、1.5mlの抽出バッファー＃3を含む液2ml、マイクロチューブを用意する。 紡糸管（ステップ2.7）から上清を除去し、抽出緩衝液第3位の300μLでペレットを懸濁する。最初のバッファの小さなボリュームを追加する＃3、ペイントブラシでペレットを中断し、残りのバッファを追加します。 ステップ2.8で作成した1.5​​ mLの抽出バッファー＃3の上に慎重にピペット中断ペレットを（ステップ2.9）。二つの相が混在しないことを確認してください。 4℃で16000 × gで1時間のためにスピン℃に上清を除去し、超音波処理のバッファの300μLでペイントブラシでクロマチンペレットを中断。 約400bpのDNAの大きさに、sonotrodeと、または超音波浴中でクロマチンを超音波処理してください。超音波処理するときに、クロマチンは° Cは熱に敏感な架橋を保護するために約30以上に加熱されることはありませんことを確認してください。それは別の超音波デバイスの間に著しく変化するため、超音波処理の期間は、実験的に決定する必要があります。ガイダンスについては、二つの異なるデバイスの設定が用意されています： 設定は25％の電力で0.6mL微量遠心管でBandelinブランドsonotrodeを公開クロマチ​​ンと超音波処理のための5倍〜20バースト、周期= 50。氷浴では20 番目のバーストの後に、編集作業中に、涼しいサンプル。 DiagenodeのBioruptor超音波洗浄機と超音波処理の場合は、水と氷で風呂を記入し、"高"に設定して1.5mlのマイクロチューブに30秒間十倍を超音波で分解する。毎30秒後、別の30秒間クールなサンプル。 スピンは4で16,000 gで5分間サンプルを超音波処理℃で溶解していない物質を沈殿させる。上清を直接免疫沈降に使用することができます。また、サンプルは、衝撃、液体窒素で凍結し、-80℃で保存できますさらに使用するまでのC。 3。免疫沈降 40μlのタンパク質 – 抗体 – 結合バッファーのアガロースおよび1.8mLを含む2 mLのマイクロ遠心チューブを準備します。クロマチンの調製（ステップ2.13）の200μLを追加。 オーバーヘッドシェーカーで1時間のためのチューブをインキュベートします。 プロテインA -アガロースビーズを破棄し、免疫沈降のために上清を使用してください。 クロマチンの濃度を（'input'）を決定するために40μlの-アリコートを削除します。 30μlのプロテ​​インA -アガロースおよび400μL音波処理クロマチンの懸濁液に特異的な試薬と設備の下の表に示されている修正特異的抗体の量を追加します。 4時オーバーヘッドシェーカー上で2.5時間または一晩インキュベート℃に 440 xgで2分間ビーズをスピンダウン各洗浄バッファーの900μL（下のリストを参照）ビーズペレットを洗浄します。各バッファの場合は、4℃でオーバーヘッドシェーカーで10分間バッファーでビーズをインキュベートして、440 xgで2分間スピンし上清を捨て、そして次のバッファを追加します。 低塩の洗浄バッファー高塩分洗浄バッファー LiClを洗浄バッファー TE洗浄バッファー最終洗浄後、完全に残っているバッファを削除します。 4。ヒストンとDNAの脱架橋、および沈殿したDNAの精製アガロースをペレットと40μlの"入力"のサンプル手順3.4、ボルテックスミキサーで5分のミックス、スピンのサンプルから、とincuに脱架橋バッファー100μLを加える℃で一晩65℃で脱灰する。 市販のDNAやPCR精製キットでDNAを精製。 通常は最後のカラム溶出液の1:5希釈の5μlのは、実行するのに十分であり、従来の遺伝子座特異的リアルタイム定量RT – PCR（RT – QPCR）。 5。バッファの表 架橋バッファ 酪酸ナトリウム 10mMのスクロース 400mmのトリス- HCl、pH8.0の 10mMの β-メルカプトエタノール 5mMのホルムアルデヒド 3％（v / v）の 抽出緩衝液第1位 酪酸ナトリウム 10mMのスクロース 400mmのトリス- HCl、pH8.0の 10mMの β-メルカプトエタノール 5mMの完全なプロテアーゼ阻害剤 1X 抽出バッファー＃2 酪酸ナトリウム 10mMのスクロース 250mmのトリス- HCl、pH8.0の 10mMの β-メルカプトエタノール 5mMの MgCl 2の 10mMのトリトンX – 100 1％（w / v）の完全なプロテアーゼ阻害剤 1X 抽出緩衝液第3位 酪酸ナトリウム 10mMのスクロース 1.7M トリス- HCl、pH8.0の 10mMの β-メルカプトエタノール 5mMの MgCl 2の 2mMのトリトンX – 100 0.15％（w / v）の完全なプロテアーゼ阻害剤 1X 超音波処理のバッファ トリス- HCl、pH8.0の 25mMの EDTA – NaOHで、pH8.0の 5mMの SDS 0.5％（w / v）の完全なプロテアーゼ阻害剤 1X 抗体結合バッファー トリス- HCl、pH8.0の 50mmの EDTA – NaOHで、pH8.0の 1mMの NaClの 150MM トリトンX – 100 0.1％（w / v）の 低塩の洗浄バッファー NaClの 150MM SDS 0.1％（w / v）のトリトンX – 100 1％（w / v）の EDTA – NaOHで、pH8.0の 2mMのトリス- HCl、pH8.0の 20mMの 高塩分洗浄バッファー NaClの 500mmの SDS 0.1％（w / v）のトリトンX – 100 1％（w / v）の EDTA – NaOHで、pH8.0の 2mMのトリス- HCl、pH8.0の 20mMの LiClを洗浄バッファー リチウム塩化 250mmのノニデット- P40 1％（v / v）のデソキシコール酸ナトリウム 1％（w / v）の EDTA – NaOHで、pH8.0の 1mMのトリス- HCl、pH8.0の 20mMの TE洗浄バッファー EDTA – NaOHで、pH8.0の 10mMのトリス- HCl、pH8.0の 1mMの Decrosslinkingバッファ トリス- HCl、pH 6.8の 62.5mM NaClの 200mmの SDS 2％（w / v）の DTT 10mMの 6。代表的な結果： βをエンコードするシロイヌナズナPR2防御遺伝子の発現抗菌活性を持つ1,3 -グルカナーゼ12は 、ベンゾチアジアゾール（BTH）、植物ホルモンであるサリチル酸3の合成アナログで誘導した。 図1は、PR2の発現の活性化は、ヒストンのリジン残基のアセチル化の増加に関連付けられている実証PR2プロモーター上のH3とH4。ヌクレオソーム密度が遺伝子の活性化は13減少するため、ヒストンアセチル化の値は、ヒストン3の不変領域に対する抗体を用いて得られた信号のために標準化した。 図1 BTHは、シロイヌナズナのPR2プロモーターのヒストンアセチル化を誘導する 。植物は100μMBTHまたは水和剤のコントロールで処理した。 72時間後、葉を採取し、クロマチンを単離した。アセチル化 – 特異的抗体（図に示される）で沈殿後に得られた信号は、ヒストンH3の不変ドメインに対する抗体で沈殿させることにより得られる信号に対して標準化した。沈殿したクロマチンは、RT -定量PCRにより定量した。データは、BTHの治療がない場合のヒストン修飾のレベルの標準化されています。