Tecnologia IgY: Extração de anticorpos de gema de ovo de galinha por polietileno glicol (PEG) Precipitação

1. Protocolo – IgY-extração por meio de PEG-precipitação Fig. 1 apresenta o esquema do processo de extração de IgY (ver Tabela 2). O protocolo foi descrita pela primeira vez em Polson et al. 1980. Todas as etapas devem ser executadas usando luvas de látex. A casca é cuidadosamente rachada ea gema é transferido para uma "colher de gema", a fim de remover o ovo muito branco quanto possível. A gema é transferido para um papel de filtro e rolou para remover restantes clara de ovo, a gema, em seguida, a pele é cortada com uma lanceta ou um instrumento similar (pipeta ponta). A gema é colocada em um tubo de 50 ml eo volume de ovos está registrado (V1). Duas vezes o volume de gema de ovo PBS é misturado com o (ΣV1 + V2) gema, PEG 6000 depois de 3,5% (em grama, pulverizado) do volume total é adicionado e agitadas, seguido por 10 min que rola em um misturador de rolamento. Essa etapa do procedimento de extração separa a suspensão em duas fases. Uma fase consiste em "sólidos gema e substâncias gordas" (citação original de Polson et al. 1980) e uma fase aquosa contendo proteínas IgY e outros. Os tubos são centrifugados a 4 ° C por 20 min (10.000 rpm de acordo com a 13000 xg Heraeus Multifuge 3SR +, rotor ângulo fixo). O sobrenadante (V3) é filtrado através de um filtro dobrado e transferidos para um novo tubo. PEG 6000 8,5% em grama (calculado de acordo com o novo volume) são adicionados ao tubo, agitadas e rolou em um misturador evolutivo como no passo 3. Repita o passo 4 com a diferença que o sobrenadante é descartado. O pellet é cuidadosamente dissolvidos em 1 ml de PBS, por meio de um bastão de vidro eo vortexer. PBS é adicionado a um volume final de 10 ml (V4). A solução é misturada com PEG 6000 12% (w / v, 1,2 grama) e tratados como no passo 3 (vortex, rolando). Repita a etapa 6 e dissolver o sedimento cuidadosamente em 800 mL de PBS (vidro vara e vortex). Espere que as bolhas de ar para desaparecer e em seguida, transferir (pipeta) o extrato de uma cápsula de diálise. Lavar o tubo com 400 mL PBS e adicionar o volume para o dispositivo de diálise (V5). (Para a preparação de dispositivos de diálise e membranas ver anexo). O extrato é dialisada durante a noite em solução salina 0,1% (1.600 ml) e agitado suavemente por meio de um agitador magnético. Na manhã seguinte, a solução salina é substituído por PBS e dialisado por mais três horas. Posteriormente, o extrato de IgY é retirado da cápsula de diálise através de uma pipeta e transferidas para tubos de 2ml. O volume final é de cerca de 2 ml (V6). O teor de proteína (mg / mL) das amostras é medida por fotometria em 280 nm (1:50 diluído com PBS) e calculado de acordo com a lei de Lambert-Beer, com um coeficiente de extinção de 1,33 para IgY (ver fig. 2), Fig. . 4 mostra a qualidade da preparação (pureza e recuperação são cerca de 80%). É aconselhável para armazenar as amostras em alíquotas a -20 ° C (não congelar as amostras a -70 ° C). A qualidade dos preparativos finais é analisada por SDS-PAGE simples como descrito no protocolo JOVE http:/www.jove.com/details.php?id=1916 2. Apêndice-antes de usar o saco de diálise deve ser preparado da seguinte maneira de acordo com as recomendações do fabricante: 20 sacos de diálise são cortadas em pedaços de 30 cm e dado num copo de vidro 2000 ml. 1750 ml de 5 mM EDTA-solução são adicionados. Um funil de vidro é colocado acima dos sacos para garantir que os sacos são cobertos pela solução de EDTA. A solução é aquecida e fervida por 5 min (placa quente). A solução é decantado e os sacos são lavadas três vezes com água destilada. Mais uma vez 1750 ml EDTA-solução são adicionados, fervido por 5 min e lavadas três vezes com água destilada como acima. Finalmente os sacos de diálise são fervidos por 10 min em água destilada e armazenado a 4 ° C. Tirar os sacos de diálise por meio de pinças esterilizadas. 3. Resultados representativos Figura 1. Diagrama esquemático de IgY-extração por meio de precipitação de polietileno glicol de acordo com a descrição original de Polson et al. 1980. Para ver uma imagem maior clique aqui. Figura 2. Desenvolvimento do total-IgY na gema de ovo de galinhas imunizadas na dependência de idade. Dado é a média semanal do total IgY / ovo e SD (n = 4 galinhas poedeiras). A partir de [Pauly et al. 2009]). Figura 3. Layimonitoramento capacidade ng de quatro galinhas imunizadas com diferentes antígenos. As setas indicam data de vacinação (de [Pauly et al. 2009]). Para ver uma imagem maior clique aqui. Figura 4. Poliacrilamida Gelelectrophoresis de preparações individuais IgY de ovos diferentes sob condições redutoras Pista 1 – marcador de peso molecular, Lane 2 – IgY-padrão, Lane 05/03 – IgY amostras diferentes preparado como descrito no protocolo. Estes são os últimos preparativos de acordo com o passo 10 do protocolo. HC – cadeias pesadas, LC – chaines luz,? – Impurezas menores correspondente ao peso molecular em torno de 35 kDa (provavelmente o fragmento C-terminal de vitelogenina precursor II, [Klimentzou et al, 2006.]).   Chicken 21 (A Antigen) Chicken 22 (um antígeno) Chicken 19 (B Antigen) Chicken 23 (C Antigen) Número de ovos (IgY total) 1, 2 anos-período 625 (38 g) 626 (38 g) 545 (33 g) 608 (37 g) Número de ovos (IgY total), primeiro ano 345 (20 g) 304 (16 g) 326 (18 g) 308 (17 g) Número de ovos (IgY total), segundo ano 280 (18 g) 322 (21 g) 219 (15 g) 300 (20 g) % Do valor máximo. número de ovos possível (primeiro ano) 2 106 93 100 95 % Do valor máximo. número de ovos possível (segundo ano) 86 99 67 92 número de ovos processados 565 620 283 401 1 A quantidade de IgY total é calculado pela multiplicação do número de ovos por um valor médio de 60 mg de proteína por ovo de acordo com os dados da Figura 2. O 2 max. número de ovos por ano é possível 325 de acordo com uma informação do criador. Tabela 1. Estatísticas Dois anos de capacidade de postura de ovos de galinhas imunizadas com diferentes antígenos. Deitado capacidade em por cento do máximo de quatro galinhas após a imunização com antígenos diferentes, bem como o resultado IgY durante dois anos (ver também a fig. 3), [Pauly et al. 2009]). Nr ovo. Nr galinha. Deitado Data V1 [ml] yolk V2 [ml] PBS 1. PEG prec. [G] Vol [ml] após 2. PEG prec. [G] Pastilha 3. PEG prec. [G] Pastilha Vol [ml] Proteínas totais mg / ml Corrigida de proteína total mg / ml 2xV1 ΣV1 + V2 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 prec., centrif. V3 e filtração 8,5% [w / v] V3 dissolvido em PBS ml V4 12% [w / v] V4 Dissolvido em PBS ml V5 Após diálise contra PBS V6 A280/ml A280/ml: 1,33 1 H293 / 22,10. 15 30 45 1,58 31 2,63 10 1,2 1,2 1,7 35,0 26,3 2 H293 / 23h10. 13 26 39 1,37 25 2,12 10 1,2 1,2 1,7 28,8 21,6 Tabela 2. Protocolo Exemplar de PEG precipitação