测量细菌感染小鼠和免疫反应李斯特菌</em

1。培养和长期储存的单核细胞增生李斯特菌 （ 李斯特 ） 制作或购买前的马血琼脂（HBA）板。干板前，孵化前使用，在37 ° C过夜或放置在一个1小时的层流柜中发现的。 获得以下可行的李斯特菌感染小鼠组织匀浆，冻干股票，冰冻甘油库存，或从最近的李斯特文化（即不到一个星期岁，而不是子培养超过10代）的殖民地。所有李斯特应使用无菌接种环和用人无菌操作技术，在本议定书中所描述的所有方法获得。 李斯特菌数，如图1所示，用无菌接种环的一个HBA板：连胜以上的板面为主要接种传播的四分之一李斯特。从小学蔓延一系列单向条纹。重复裸奔的2-3倍，一个新的或重新消毒的循环使用之前，每个条纹。孵育37℃过夜板。 李斯特的HBA板保存在4 ° C为1个月的最高内，或转到步骤1.5准备长期储存李斯特文化。 单菌落挑选新鲜李斯特文化上HBA板用灭菌接种环和接种10毫升脑心在30毫升麦卡特尼瓶输液（BHI）肉汤（准备根据制造商的指示）。 李斯特文化在180rpm轨道摇床孵育37℃过夜。 无菌甘油80％（V / V）以1:1的比例添加到液体李斯特文化获得最终甘油浓度为40％（V / V）。转移到离心管0.5-1毫升分装和李斯特 /甘油股票存放在-70 ° C。 提示及注意事项： 李斯特菌的生长，可以支持不同的非选择性的媒体，如血琼脂（马，羊，豚鼠或人血补充）的范围内，脑心浸液（BHI）的琼脂或肉汤，或用酵母胰蛋白酶大豆肉汤，提取物（TSB – YE）。文化添加抗生素李斯特菌菌株媒体定义的抗生素耐药性（ 如李斯特菌10403S），或通过使用牛津媒体，选择性地支持李斯特菌的生长，可以减少污染的增长。 如果李斯特菌是从一个未经考验的源得到的，它是建议进行额外的测试，确认身份的李斯特菌（李斯特菌是革兰氏阳性，不形成孢子，游动在<30 ° C，兼性厌氧，过氧化氢 ​​酶阳性，并氧化酶负）。获得文化也可以李斯特菌选择性培养基上生长，以确保获得一个纯粹的文化。 干燥的HBA板，确保有最佳的分离盘上的细菌菌落。 李斯特菌的冷冻甘油股票时，使用新鲜的HBA小于1周龄和尽可能少的几代人（<5最好）子培养李斯特文化。 派生从冰冻甘油的新鲜李斯特文化时，第一段应该是固体培养基（即HBA卡板）， 因为李斯特从冷冻甘油股票获得增长不佳时，直接在液体培养基中传代培养。 2。 李斯特菌的传染性股的制备及储存在体内的感染研究数到HBA板李斯特从一个冷冻甘油（步骤1.7）中所述步骤1.3。孵育板在37 ° C过夜第二天。 从连败的文化选择单一的李斯特菌菌落，接种在10 mL BHI肉汤。避免转移到肉汤琼脂。 李斯特 BHI文化孵育在轨道摇床180 rpm和37 ° C中旬对数生长期（OD600 =〜0.4）。这通常需要3-4个小时。 以0.9毫升分装在无菌条件下，并获得在摇晃的3-4个小时在600 nm的OD阅读。如果外径读<0.3，然后继续在轨道摇床文化在180 rpm和37 ° C直到外径阅读〜0.4。 加入1 mL无菌80％甘油（V / V）10毫升李斯特 BHI肉汤培养（OD600〜0.4）。轻轻混匀，并在0.5-1毫升分装转移到1.5 ml离心管。 的等分放在冰上10分钟和存储于-70 ° C。留出一等分解冻，以确定传染病股票中的浓度，李斯特菌，通常是在10 9 CFU / mL的秩序。 执行1:10系列稀释的unfro禅宗李斯特菌的传染性股票 10-8稀释在PBS 。重复使用的玻璃吊具100μL未稀释和其后每稀释，扩散到预干燥的HBA板（1.1步）。孵育37℃过夜板。 每盘计数菌落数，并决定冻结传染病的股票文化的李斯特菌的浓度，使用以下的计算：浓度（CFU / ml为）= x稀释倍数/ 0.1毫升菌落数。计数选择板块最好30-300殖民地活菌CFU浓度，以确保可靠的估计。 几天李斯特菌的传染性股票后储存于-70℃，出一管解冻。步骤2.7和2.8中所述，确定可行的李斯特菌的浓度。这个浓度应该是相似的的新鲜配制的步骤2.8传染病股票确定。 提示及注意事项： 李斯特菌的传染性股票被冻结在一个较低的百分比比一般长期储存（40％） 冻结李斯特（8％）的甘油。 冷冻李斯特菌的传染性股票通常长达3个月稳定在-70 ° C 。如果超过3个月的使用，这是建议，新的传染病股票李斯特从一个全新的文化上的HBA板准备。 如果是新鲜配制的步骤2.7和2.8所述的股票不同浓度（2.9步）的李斯特菌的传染性股票解冻（即> 20％下降CFU），然后一个新的冷冻传染病股应有所准备。 虽然最初有更多的时间消耗比准备一个新鲜的细菌接种一次实验，编制冻结李斯特菌的传染性股票，使感染和更好的实验之间的一致性，当老鼠感染来自同一冻结股票之前的CFU浓度的准确测定。 3。 李斯特菌接种和静脉注射的小鼠的制备确定李斯特菌的浓度为每鼠注射。用于静脉注射，在200μL，接种每鼠CFU使用。 解冻冻结了李斯特菌的传染性股票等分（步骤2.6）。股票所需的李斯特菌的菌落形成单位浓度稀释在PBS传染病。双注入所有小鼠，以确保有足够的接种注射和决心所需要的体积李斯特 CFU前和注射后（步骤3.3和3.7）。 删除2X准备李斯特菌接种0.1毫升分装，并准备在PBS 1:10稀释的小鼠注射前为每个等份。每个稀释的HBA板的板0.1毫升，并在37板一夜之间° C。计数菌落数，并确定李斯特菌接种前注射浓度：浓度（CFU / ml为）=（菌落数x稀释倍数）/毫升，稀释倍数镀。 转移到一个干净的笼子注入鼠标。笼放置时间为5分钟（其他合适的热设备，不会烧的鼠标或温度高于40 ° C也可以被用来增加笼）〜50厘米，下一个250瓦的红外线灯的暖鼠标。鼠标放置在尾静脉注射的束缚设备。 轻轻地混合李斯特菌悬浮液保持一致悬挂，每一个注射器加载时间。 找到尾静脉鼠标，轻轻擦拭用70％乙醇擦拭，并注入200μL 李斯特菌接种所需浓度，使用27号针头与注射器。进入伤口，用无菌纱布简要施加压力。返回鼠标笼子里。 当所有小鼠注射完毕后，重复步骤3.3使用的接种剩余的金额， 以确定李斯特菌接种注射后的浓度。 李斯特菌注入到小鼠的数量确定前和李斯特菌接种注射后样品的平均CFU报道。 提示及注意事项： 我们通常注入500 – 3000 CFU（200微升2500 CFU / ml为 – 15000 CFU / mL的接种量）进行比较时，细菌和免疫反应之间的抗小鼠品系（如C57BL / 6）和易感小鼠品系（如BALB / C ）。 如果传染病的股票将在PBS稀释至少10 5，然后洗涤步骤一般不要求，以去除残留的媒体/甘油。如果感染的股票不会在PBS稀释至少10 5，然后洗涤步骤应添加在步骤3.2删除残留媒体/甘油如下：日9毫升PBS解冻传染病的股票和10分钟离心收集细菌在2100 XG 4 ° C。去除上清液，并重新悬浮在10 mL无菌PBS，重复离心颗粒的细菌细胞，细菌细胞沉淀重悬在所需卷。确定前和注射后的李斯特菌接种步骤3.3和3.7中描述的样品平均菌落形成单位。据悉，这种洗衣机的步骤可能会导致一些细菌的损失，并建议事先确定此类损失占所需浓度接种。 安全丢弃的注射器和针注射后鼠标李斯特 。 4。分析李斯特菌感染小鼠肝脏和脾脏去除 Euthanase感染小鼠，在使用由当地动物伦理委员会，如CO 2窒息批准的方法所需的时间点后感染。 心脏出血后立即执行安乐死使用1 ml注射器和25号针头。收集尽可能多的血。取出胆囊，切断下腔静脉。 仔细推到右边的肠子暴露肝门​​静脉，翻转向头部向左侧，使肝脏是坐在位于隔膜的肝叶。肝门静脉进入肝脏的底部，从较低的右侧饲料。 灌注肝脏肝门静脉使用26号针头注入10毫升PBS。通过门静脉注射PBS将退出从切断的下腔静脉。肝脏灌注，确保提取的干细胞，肝脏和血液循环。 取出老鼠的体腔，在流式细胞仪缓冲的地方，并储存在冰灌注肝脏。肝的流式细胞仪分析的准备，请转至步骤5.1。 卸下鼠标，在流式细胞仪缓冲的地方，并储存在冰脾。 权衡整个脾，减少了一半，重量一半之一。放置一个半流式细胞仪缓冲并转到步骤6.1。广场的另一半在抹胸冰包，请转到步骤7.1。 提示及注意事项： 在4.5和4.6的步骤，使用流式细胞仪的缓冲区足够完全淹没的组织，以尽量减少暴露到空气组织的任何部分。 一个半英寸长26号针头〜30度弯曲，可以更好地促进进入肝门静脉PBS注射。 当灌注正常，肝，变成暗红色的颜色为浅棕色注射后1-2毫升PBS。 如果肝脏不适用于流式细胞仪分析，灌注是没有必要的。可以分离肝脏，并直接进入一个抹胸袋收集和处理，在第7步中所述。 对于安乐死的小鼠，CO 2窒息是首选方法，因为它具有对细菌的CFU，并在脾脏和肝脏免疫细胞活力的影响微乎其微。如果不需要采血，颈椎脱位，可作为替代安乐死方法。这是建议，安乐死的方法，可能会影响器官重量或免疫细胞活力，不能使用（例如thiobarbiturates）。 5。流式细胞仪检测肝细胞悬液的制备生成单细胞悬液，流式细胞仪缓冲液（4.5步）在70微米的细胞过滤器，一个60毫米的培养皿内放置肝。推动通过组织的细胞，直到形成一个单细胞悬液，过滤器使用5毫升注射器的柱塞。 从培养皿中的肝单细胞悬液转移到50 mL锥形螺丝帽筒，并带来总量的40毫升冷流式细胞仪缓冲。 涡细胞悬液，取1 mL的等份，以确定肝脏的细菌负荷。转到步骤7.3和使用1毫升分装在地方组织匀浆抹胸袋。 500 XG为5分钟，4℃，离心沉淀细胞弃上清，重悬沉淀在40毫升冷流式细胞仪缓冲，颗粒在500 XG离心5min后的细胞在4 ° C，并弃去上清液。 重悬细胞沉淀在室温20毫升等渗Percoll。在室温为12分钟在700 XG离心细胞悬液。弃上清和圆盘状浮在上面的细胞的表（即肝细胞）。在4毫升交咨会缓冲液重悬白细胞含颗粒裂解红细胞和培育细胞，在室温高达10分钟频繁反转。 通过100微米到一个新的10 mL离心管的尼龙膜过滤细胞悬液。 底图过滤细胞悬液，用1 mL FCS / EDTA缓冲。在350 XG离心机5分钟在4 ° C，弃上清液，并在5毫升流式细胞仪/ EDTA缓冲液悬浮。 离心5分钟350 XG细胞悬液，在4 ° C，弃上清液，重悬细胞沉淀在0.5-3毫升流式细胞仪/ EDTA根据颗粒大小的缓冲区。 根据步骤5.8悬浮量稀释细胞悬浮在台盼蓝1:5-1:20。计数可行肝白细胞使用hemacytometer（图4A），并确定总活菌如下：活细胞/器官=计数面积×稀释倍数× 10 4 X宗卷（ML）的细胞。肝脏单细胞悬液，然后与所需的细胞表面标志物的特定抗体标记和流式细胞仪分析。 提示及注意事项： 除另有注明外，细胞置于冰上。 6。流式细胞仪分析脾单细胞悬液的制备生成与流式细胞仪缓冲放置在一个70微米的60毫米培养皿内的细胞过滤器，脾的一半（步骤4.7），单细胞悬液。通过细胞过滤器使用5毫升注射器的柱塞，直至形成一个单细胞悬液，轻轻推入组织。 从培养皿中的脾单细胞悬液转移到10 mL离心管中，使总体积至10 mL，使用冷流式细胞仪缓冲区。 4毫升交咨会缓冲在350 XG为5分钟，4℃，离心沉淀细胞弃上清，悬浮细胞沉淀在室温下长达10分钟频繁反演裂解红细胞，孵育细胞。 通过100微米到一个新的10 mL离心管的尼龙膜过滤细胞悬液。 底图过滤细胞悬液，用1 mL FCS / EDTA缓冲。在350 XG 5分钟在4 ° C离心，弃上清，重悬细胞沉淀于5 mL流式细胞仪/ EDTA缓冲。 离心5分钟350 XG细胞悬液，在4 ° C，弃上清液，重悬细胞沉淀3-8毫升流式细胞仪/ EDTA根据颗粒大小的缓冲区。 稀释细胞悬液，1:10 – 1:20在台盼蓝（在蒸馏水中的0.4％），悬挂在步骤7.6量而定。计数使用hemacytometer的可行脾 – 见步骤5.9计算每个器官脾单细胞悬液的总活菌，然后可以为所需的细胞表面标志物是特定的抗体标记和流式细胞仪分析。 提示及注意事项： 除另有注明外，细胞置于冰上。 7。 李斯特菌感染小鼠组织中的细菌负荷的测量褶皱抹胸脾半袋的顶部。虽然拿着胸衣袋关闭，以防止渗漏，把它平放在一个干净的工作台或层流柜中。翻转组织厚的圆笔，直到组织内袋泥。 添加5毫升的PBS每个抹胸袋，含泥组织。放入抹胸抹胸袋，和10分钟高速运行的抹胸。 在抹胸袋（或肝细胞悬液1毫升分装）用移液器混合匀浆。在重复执行以下。 300μL，转移到96孔平底板。在96孔板的孔执行1:10系列稀释（30到270μL的PBS液）为每个组织匀浆样品稀释10 -5。 小心地使用玻璃吊具到预干燥的HBA板0.1毫升每个稀释度。孵育37℃过夜板。 计数每个稀释度的CFU数量，并计算出每组织的CFU，考虑到部分组织（如半脾），稀释倍数，组织匀浆的总体积（5毫升或40毫升）：菌落形成单位/组织= CFU/0.1毫升x稀释系数x毫升/组织;为脾用于组织同质化脾样本的重量百分比（见第4.7步）除以这个数字。 提示和注释： 在总量的时间超过一个抹胸袋可放置在胸衣制造商指定的不超过最大音量如果一个抹胸不可用，可以用来代替一个组织匀浆。另外，下面的方法，虽然效率不高，还可以用来手动浸渍步骤7.1和7.2的地方机关：地方机关在一个密封的消毒塑料袋和一个洁净工作台奠定同时关闭，防止漏袋。卷袋500毫升的实验室玻璃瓶重复，直到该组织是彻底捣碎。添加5毫升的PBS，每个袋子，并继续执行步骤7.3。 这是非常重要的步骤7.4，充分干燥的HBA板（即没有琼脂中的水分）。否则，它可能是很难获得不同的，可以算作正确的李斯特菌菌落。 如果是有限的HBA板，替代步骤7.4：一个预干燥的HBA盘（步骤1.1）分成五至六个部分，每个稀释度的底部画线。仔细移液器25μL，每个稀释到每个组织匀浆的HBA板的相应部分 – 不要用吊具传播。等待，直到滴组织匀浆前反相板干。孵育37℃过夜板。 80殖民地可以区分因一滴琼脂平板上。 组织匀浆稀释可能取决于李斯特菌生长在动物和动物安乐死的时间显示在症状的基础上，可以预计。小鼠有明显的奄奄一息，那么额外的稀释可能是必要的，以便更准确地确定细菌负荷。对于低剂量李斯特菌或人道毁灭的小鼠在感染期的结束接种小鼠，未经稀释的组织匀浆可用于确定细菌负荷。 培养板可在37 ° C过夜或在室温下2-3天。 8。代表性的成果： 对于一个标准的感染实验中， 李斯特菌是获得从冻结的甘油和条纹上的HBA板如图1所示。如果几个殖民地裸奔后获得的，这可能表明穷人的条纹或比最佳冻结的股票。 李斯特菌的传染性股准备从新鲜挑染HBA板，并保存于-70 ° C测量细菌清除和免疫反应中，我们经常至2500 CFU / mL的稀释解冻的李斯特菌的传染性股票- 15,000 CFU /毫升，并注入200μL的小鼠感染500 – 3000 CFU。我们观察到，与亚致死剂量使用此协议的李斯特菌感染的小鼠可能瞬时展览竖起皮毛，弯腰驼背的姿势和减肥的最初几天内。这些症状的视觉线索提供了一个单独的鼠标是如何严重感染影响，是否响应不同，其余各组（即一个“明显的”离群），是否安乐死是必要的，以防止过度的痛苦和即将到来的死亡由于感染。 在图2-5所代表的结果，使用新鲜李斯特菌感染的股票解冻等份小鼠感染。感染后，在不同时间点小鼠人道毁灭和肝，脾被拆除。图2显示了从一个单一的鼠标稀释脾匀浆培养一个HBA板。稀释倍数越来越高，应该有一个菌落数明显减少，例如，可能至少有两个稀释计数鲜明的CFU。如果鼠标已经清除了李斯特菌感染（即检测限为100 CFU /组织），然后将<5 李斯特菌菌落HBA上的板，200μL未稀释的组织匀浆传播。如果肝脏和/或脾成为肠道或其他外部细菌污染隔离，HBA上的板块有可能表现出不同的形态（即不会有特征的光环和李斯特菌菌落呈苍白色）和/或可能，菌落菌落计数的期望是什么不同的李斯特（即太少或太多）。图3显示了一个典型的李斯特间隙曲线C57BL / 6小鼠-注意，李斯特菌通常是更迅速地清除超过肝脏脾，通关不会发生，直到感染后5天。 图4显示了对感染小鼠的脾脏和肝脏感染后不同时间点的准备的单细胞悬液的细胞计数。这种方法可以实现在准备从肝和脾> 80％的单细胞悬液，白细胞纯度> 95％。白细胞纯度可通过使用一个特定的泛白细胞标记CD45（克隆30 – F11）的单克隆抗体的流式细胞仪分析。通常情况下，脾和肝白细胞数量增加期间需要清除肝脏表现出更大的肝脏白细胞倍的感染，而是一个相当小的总相比，脾脾在增加。免疫细胞的类型和数量可以由标签与特定的细胞表面标记的抗体的单细胞悬液。标记细胞，然后可以用流式细胞仪分析检测。图5提供了CD8 + T细胞的代表性成果。在一个标准的李斯特菌感染C57BL / 6小鼠，短暂的CD8 + T细胞的数量降低由于脾淋巴细胞天2-3 befor发送从感染后第5天明显增加脾脏和肝脏。 图1。 李斯特的HBA板挑染。使用无菌接种环连胜从冰冻甘油李斯特 。该板块在37℃过夜孵育。特征单个菌落周围的光环是由于β溶血。 图2。组织匀浆培养一个李斯特菌感染小鼠的HBA板。一个肝脏是从李斯特菌感染的C57BL / 6小鼠在感染后3天收获。准备和组织匀浆稀释为100μL全为10 -4稀释（A）和10-5稀释（二）扩散板，以及25μL滴在HBA板放在每个1:10稀释未经稀释到10 -5（C）。该板块在37℃过夜孵育。稀释，使单个菌落计数是用来确定在这个时间点后感染细菌负荷（即CFU /组织）。 图3。感染C57BL / 6小鼠在感染后3和7天的脾脏和肝脏中的李斯特菌负荷。 C57BL / 6小鼠感染李斯特菌 〜2,000 CFU。在每个时间点，老鼠被人道毁灭，肝脏灌注和收获具有健脾，和脾匀浆（A）或肝单细胞悬液（二）稀释的HBA板培养，以确定细菌负荷。实线表示的几何平均值，竖线表示教育统筹局局长。虚线表示，细菌负荷的精确测量的检测限为100 CFU /本实验的器官。 图4。感染小鼠组织的活细胞计数。 C57BL / 6小鼠感染李斯特菌 〜2,000 CFU。在每个时间点，老鼠被人道毁灭，肝脏灌注，具有健脾收获。细胞与台盼蓝染色，计数描述的步骤5.9（一）使用一个hemacytometer。获得单细胞悬液，准备从李斯特菌感染小鼠脾细胞（B）和肝白细胞（三）计算。行表示的几何平均值。 图5。流式细胞仪分析的CD8 + T细胞在李斯特菌感染小鼠。 C57BL / 6小鼠感染李斯特菌 〜2,000 CFU。在每个时间点，老鼠被人道毁灭，肝脏灌注，具有健脾收获。单细胞悬浮液染色与特定的T细胞（CD3 +，TCRβ，CD4，CD8细胞）的抗体。 （一）代表流式细胞仪型材％CD8 + T细胞+ / -扫描电镜。 （b）总CD8 +脾T细胞。 （c）总CD8 + T细胞在肝脏。