Автоматизированная гидрофобные взаимодействия хроматографии на колонке выбора для использования в очистки белков
Summary
Автоматизированный метод определения подходящей гидрофобные взаимодействия хроматографии (МКХ) средства массовой информации, которые будут использоваться в процессе очистки белков представлен. Метод использует среднего давления жидкостной хроматографии в том числе автоматизированные системы смешивания буфера динамической впрыск топлива образца, последовательный выбор колонки, многоволновых анализа и разделения долей элюата коллекции.
Abstract
In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or “scouting”) in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.
Protocol
Discussion
Жидкие методы хроматографии являются неоценимым для подготовки высоко очищенных белков, необходимых для проведения иммунологического 6, биохимические 7, 8 и структурных исследований. МКХ методы очистки чаще всего требуют эмпирического определения предпочтительной средой, и лиганд структуры, плотности лиганда, а матрица шарик свойства все было показано, что влияние результатов хроматографического 2, 3. Автоматизированная колонке разведки является эффективным подходом к выбору МКХ средой для последующей оптимизации и очистки белков 4. Автоматизированный метод разведки колонке представлены может быть легко адаптирована к различным МКХ стратегии очистки белков. Изменения в концентрации солей, выбор соль, соль градиент рН и может еще улучшить условия очистки, а также влияние изменения этих основных параметров были ранее рассмотренных 13,14. МКХ элюата содержащую частично очищенный целевой proteВ дальнейшем можно очищают, используя дополнительный метод хроматографического, таких как ионообменной хроматографии (IEX) или гель-фильтрации / размер хроматографии 9,10.
Благодаря своей уникальной поглощения света и эмиссионные характеристики, профиль элюирования GFP можно получить, используя в линию и после выполнения подхода. В связи с этим, этот протокол может быть дополнительно адаптирована для очистки рекомбинантного GFP-гибридных белков, в которых не связаны белка-мишени в «меченых» с GFP. GFP-меченных белков цели могут быть обнаружены с помощью ультрафиолетового излучения 11 и очищенной с помощью различных хроматографических подходов, в том числе МКХ стратегии очистки, описанной выше. GFP очистки также стала основной в педагогической лаборатории биохимии для обучения современным методам научных белка 12.
В то время как основные МКХ очистки белков могут быть проведены с использованием значительно менее надежные хроматографии систвола, приборы, представленные здесь имеет ряд явных преимуществ, чтобы помочь в получении положительных результатов. Заметные преимущества использования высоко автоматизированные системы включают улучшение запуска к запуску условиях воспроизводимости, экономия времени и снижение возможностей для воздуха должно быть введено в систему 10. Система контролируемого буфер смешивания, которая способствовала система максимайзер, позволяет увеличить последовательности в подготовке буфера и экспериментальной воспроизводимости. Опираясь достаточно нагрузки образца в динамическом цикле образец для всех разведку работает также обеспечивает однородность образца добавляется в каждом столбце и позволяет последовательное работает без перерывов или ручной перезарядки. Контролируемые инъекции образец из выборки цикла на колонку уменьшается изменчивость, которые могут произойти с ручной загрузкой образца. Пара клапанов выбора столбца позволяют последовательно работает образца, каждый из которых использует различные МКХ колонке, без replumb системы. Выполнение мно Ti-волны анализ особенно полезен при анализом белков с уникальной спектрофотометрического профиля. В дополнение к GFP, цитохромов, флавопротеидов и других гем-содержащих белков могут получить выгоду от этой техники. Устройства проводимости и рН мониторинга позволяет для проверки в реальном времени экспериментальных условиях. Сплит часть элюата коллекция позволяет улучшить обработку фракции и позволяет легко переносить на пост перспективе методы анализа, которые требуют минимального объема выборки (например, ИФА, SDS-PAGE, Вестерн-блот и Experion микрофлюидных электрофорез). При работе второго форума коллектор фракция требует ручной синхронизации, что позволяет обеспечить максимальную гибкость в выборе часть коллектора. Наиболее значительные недостатки использования таких надежная система хроматографии для МКХ колонке разведки и очистки белков включает в начальный момент времени и бюджетных расходов, связанных с приобретением инструмента и обучения операторов.
т "> протокол, представленные здесь используется Bio-Rad DuoFlow хроматографии системе. Однако, в равной степени надежными приборами других производителей, таких как Avant Акта от GE Healthcare, могут быть также использованы и способны производить эквивалентные результаты даже сопоставимого хроматограф обладают уникальными характеристиками (например, метод программирования, компонент номенклатуры, оператор предпочтения и масштабируемость ограничений), которые должны быть рассмотрены до начала процедуры очистки или инструмент приобретения.Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья и GM086822 грант Национального научного фонда крупных научно-исследовательских приборов грант DBI-0960313. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Джон Miyake и Донна Гарди (Bio-Rad) и Дженнифер Loertscher (Seattle University) за их техническую экспертизу. Выберите хроматографии реагентов и дополнительных приборов щедро предоставляемые Bio-Rad.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | High-pressure valve, 9-port, 8-position, 3,500 psi (233 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system |
| Diverter valve SV3T-2 | Bio-Rad | 7600410 | Solenoid valve, 3-port, 2-position, 30 psi (2 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | ||
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | Sliding-piston sample loop kit, includes 25 ml DynaLoop sliding piston loop, DynaLoop parts kit (#750-0450) |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 7410088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | gradient pump for low-pressure protein purification, includes tubing and fittings kit |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
References
- Cummins, P. M., O’Connor, B. F. Hydrophobic interaction chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for “method scouting” protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, . L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E. Fully automated protein purification. Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
