Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Mikrodalga destekli numune hazırlama Numune hazırlama birinin başlangıç ​​elektron mikroskobu için otomatik mikrodalga doku işlemci (Leica EM AMW; Leica Microsystems, Viyana, Avusturya) programlamak gerekiyor önce TEM için mikrodalga destekli numune hazırlama için aşağıdaki protokolleri (Tablo 1): Tablo 1. Mikrodalga radyasyon kullanarak numune hazırlama için protokol. Farklı sütunlar (soldan sağa) gösterir: Vial numarası (Vial no.) Şişenin işlemcinin atlıkarınca içine yüklenir sırasını temsil eder. Gerçek sürecinin Adım. Flakonlarda Reaktifler. Gerçek adım süresi. Mikrodalga ışınlama kapatılmadan önce flakon içinde ulaşılır maksimum sıcaklık. Mikrodalga radyasyon ayar: Sürekli = hızlı sıcaklık artışlarlaase, ayarlanan sıcaklık tutarak; Eğim = nazik sıcaklık artışı, sonunda ulaşılan nihai sıcaklığı; sıcaklığı 5 düştü kadar Atımlı = Hızlı sıcaklık artışı, güç kapatıldığında ° C, güç sıcaklığa ulaşmak için yeniden başladı. Mikrodalga radyasyonun Maksimum güç. Taze numune hazırlama protokolü (Agar 100 epoksi reçine için 1.7 'ye bakınız) açıklanan farklı adımları için çözümler hazırlamak, programlanan protokolü (Tablo 1) göre belirlenen şişeleri içine doldurun, atlıkarınca şişeleri yükleyin, ardından eklemek mikrodalga doku işlemci, ve içine carousel nihayet monomod odasına ilk flakon yükleyin. 60mm Sørensen% 3 glutaraldehit (Agar Bilimsel Ltd, Stansted, İngiltere) bir damla bir modelleme mumu plaka üzerinde bir jilet ile Tütün Mozaik Virüsü (TMV) ile enfekte Nicotiana tabacum yapraklarını küçük bölümler (1mm 2) Kes Oda sıcaklığında fosfat tampon maddesi (pH 7.2)erature. Hemen yaklaşık 200μm bir örgü genişliği ile belirlenen sepet içerisine ince cımbız ile bölümleri aktarın. Birbirlerinin üstüne sepetleri Yığın ve monomod odasının içine yerleştirin. Bakım örnekleri sürekli kurumasını yok ki yükleme ve sepetleri istifleme sırasında fiksatif solüsyonu ile kaplıdır dikkat edilmelidir. Fiksasyon, dehidratasyon ve infiltrasyon için önceden programlanmış mikrodalga destekli numune hazırlama protokolü başlatın. Numune hazırlama mikrodalga doku işlemci tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir iken bölüm 3 (negatif boyanma) açıklandığı gibi kalan bitki materyali ile negatif boyanma ile devam edin. Plastik bir kap içinde dolgu 24g Agar 100, 16g dodecenyl süksinik anhidrit ve 10 g metil nadic anhidrit (tüm bileşenler için Agar Bilimsel Ltd, Stansted, İngiltere bakınız), ısı: Taze aşağıdaki bileşenleri tarif gibi karıştırılarak Agar 100 epoksi reçine hazırlamak buna40 ° C ve iyice karıştırın. Benzil dimetilamin 1.2g ekleyin ve iyice karıştırın. Numune hazırlama protokolü sona (örneğin masa 1 adım 22 sırasında) gelir hemen önce belirlenen polimerizasyon içine Agar 100 epoksi reçine doldurun oluşturur. Protokol tamamlandıktan sonra (tablo 1'de basamak sonra 22) monovalent odasından gelen atlıkarınca son şişenin içine sızma numuneleri içeren yığın sepet bırakın. Mikrodalga cihazdan atlıkarınca çıkarın, sepetler Unstack ve belirlenen polimerizasyon formları içine ince cımbız kullanarak bunları yükleyebilirsiniz. Bakım örnekleri her zaman unstacking ve kurumasını yok ki yükleme sırasında Agar 100 epoksi reçine ile kaplıdır dikkat edilmelidir. Birbirlerinin üstüne polimerizasyon formları yığını. Bakım örnekleri her zaman istifleme ve kurumasını yok ki yükleme sırasında Agar 100 epoksi reçine ile kaplıdır dikkat edilmelidir. Mikrodalga tiss bir atlıkarınca daha önce kullanılmış şişeleri kaldırue işlemci, yığılmış sepetleri ile yükleyebilirsiniz ve mikrodalga doku işlemci içine carousel yerleştirin. Önceden programlanmış polimerizasyon protokolü (tablo 1) başlatın. Polimerizasyon mikrodalga doku işlemci tarafından otomatik olarak yapılır iken, bir transmisyon elektron mikroskobu ile negatif boyanmış parmaklıkları incelemek [örneğin Philips CM10 TEM, FEI (eski Philips), Eindhoven, Hollanda] ve bölüm 3 ve 4 (açıklandığı gibi görüntü analizleri Negatif boyama ve görüntü analizi). Protokol Unstack, monovalent odasından gelen polimerizasyon biçimleri polimerizasyon biçimleri kaldırmak ve numuneler içeren polimerize bloklar kaldırmak tamamlandıktan sonra. Onlar şimdi bir mikrotom ile kesitli olmaya hazırız. 2. Kırpma ve kesit Ultra ince tutucu yaklaşık yapışma üst üzerinde numune ile 1cm üzerinden kesit için ayrı numune tutucular içine bir veya daha fazla blok yerleştirin. TEM (örneğin Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems) için bir örnek düzeltici ile blok Trim böylece maksimum blok yüzü. Uzunluğu ve (yüz boyutu bloke elmas bıçak boyutuna ayarlanması gerekebilir) elde edilir mümkün olduğu kadar yaprak malzeme içeren genişlikte 200μm 1mm. 45 ° (örn. Diyatomelere Ultra 45, Gröpl, Tulln, Avusturya) bir bıçak açıda bir elmas bıçak kullanarak; bir ultramicrotome (Leica Microsystems örneğin Reichert Leica ULTRACUT S) ile Bölüm bloğu. Kısım kalınlığı yaklaşık 70 ila 90 nm olacak şekilde ayarlanmalıdır ve kesme hızı 1 mm / s civarında olmalıdır. Bir formvar (Agar Bilimsel Ltd) kaplı bakır veya nikel 200 kare mesh ızgara ile birden çok bölüm toplayınız. Kısmen 2-ücretsiz CO oluşturmak için NaOH ile dolu bir petri 5 dakika; kurşun sitrat (42ml çift distile su ve 8ml 1N NaOH içinde çözülmüş 1.1 g kurşun sitrat Agar Bilimsel Ltd) ile ızgara üzerinde bölümler Post-leke çevre ve 15 mil için% 1 uranil asetat (Agar Scientific Ltd) ile nutes oda sıcaklığında damıtılmış su içinde çözülmüştür. Her post-boyama adım arasında 1 dakika için damıtılmış su ile ızgaraları yıkayın. Hava bir ızgara kutusuna ızgaraları kurutun. Bir transmisyon elektron mikroskobu (örneğin Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Hollanda) ile bölümleri inceleyin. 3. Negatif boyama TMV ile enfekte yaprak malzeme 100mg hakkında ve 60mm Søfrensen fosfat tamponu (pH 7.2) 100μl bir mikroskop lamı üzerine bir jilet ile 2 dakika boyunca malzeme homojenize ham sap hazırlamak Hasat. 4 ya da daha çok kuyucuk (alternatif olarak parafilm bir parça üzerinde homojenat aktarmak mümkündür) bir teflon kaplı mikroskop slaytı iyi ilk üzerine çıkan Homojenat 20uL aktarın. Damla ve incu dönük formvar (Agar Bilimsel Ltd) kaplamalı yüzü Homojenat üstüne formvar kaplı ızgara yerleştirin5 dakika boyunca kesmek. 200μl 60mm Sørensen fosfat tampon maddesi (pH 7.2) ve iki damla üzerinde ızgara yerleştirerek ızgara 2 dakika için 2 defa yıkanır. Bir taze hazırlanmış% 2 fosfotungstik asit (Agar Scientific Ltd) 60mm Sørensen fosfat tampon maddesi (pH 6.5) içinde çözelti ile 1 dakika için ızgara inkübe edin. Izgara çıkarın ve bir ızgara kutusuna kurumaya bırakın. Bir transmisyon elektron mikroskobu (; FEI, Eindhoven, Hollanda örneğin Philips CM10 TEM) ile ızgara inceleyin. 21000X veya daha yüksek bir primer büyütmede transmisyon elektron mikroskobu ile rastgele seçilen olumsuz lekeli virionlar en az 10 görüntü (en az 10 veya daha fazla virionlar her görüntü üzerinde görünür olmalıdır) atın. Bakım tüm görüntüler de aynı büyütme olduğunu alınmalıdır. 4. Görüntü analizi Alınan mikrografları, üzerinde en azından 100 rasgele seçilmiş tek bir virüs partiküllerinin uzunluğu ve genişliği ölçülürherhangi bir görüntü analizi bilgisayar yazılımı kullanarak olumsuz lekeli örnekleri partikül analizi aracı veya Optimas ile [örneğin Hücre D (Olympus, Yaşam ve Malzeme Bilimleri Europe GmbH, Hamburg, Almanya) 6.5.1-(Medya Sibernetik Inc, Bethesda, Maryland, USA)]. Negatif boyama yöntemleri ve TEM ile görselleştirilmiş virüs partiküllerinin bir ortalama uzunluk ve genişlik elde etmek için ortalama ve standart sapma hesaplanır. Açıkça virüs hastalıkları belirlemek için, literatürde bilinen virüs hastalıkları tarafından uyarılan virüsler ve yapısal değişikliklerin bir uzunluk boyutlarına sahip ve yapısal özellikleri (2.5 de elde edilmiştir) karşılaştırın. 5. Temsilcisi sonuçları: Gibi mikrodalga destekli numune hazırlama tipik TMV indüklenen ultrastrüktürel değişiklikler sonra paralel biçimde hizalanmış virionlar içeren geniş alanlar enfekte Nicotian arasında sitoplazmada transmisyon elektron mikroskobu ile gözlenebilirbir tabacum hücreleri (Şekil 1A). Ayrıca TMV ile enfekte olan ham sap TMV parçacıklar negatif boyanma sonra kıvrımlı, çubuk şeklindeki yapılar (Şekil 1B) olarak gözlenebilir bırakır. 100 virüs partiküllerinin Görüntü analizi uzunluk ve genişlik olarak 17nm olarak 280 nm (Şekil 2) TMV bir ortalama boyutu ortaya çıkardı. TMV ile enfekte olmuş hücrelerine Bu çalışmada gözlenen virionlar ebadında bir ince yapı TMV parçacıkların tütün ve boyut aralığı içinde TMV bağlı ince yapı özelliklerine uygun olarak, daha önce literatürde bildirilen 9-15 olduğu tespit edilmiştir. TMV ile enfekte yaprak hücreleri ve virionlar Şekil 1. Transmisyon elektron mikroskop. A) Görüntü Nicotiana tabacum mikrodalga destekli bitki numune hazırlama sonrası TMV ile enfekte mezofil yaprak hücrelerinin ince yapısı gösterir. Sitoplazmada biriken paralel hizalanmış virionlar geniş alana dikkat.C nişasta = kloroplast (St), M = Mitokondri, N = nükleus, V = vakuol, Bar = 2μm. B) Görüntü enfekte yaprakların sap negatif boyanma tespit edildi virionlar gösterir. Şekil 2. Virionlar nispi büyüklüğü. Uzunluğu ve negatif boyanma onlar elektron mikroskobu göründüğü gibi enfekte yaprakların sap sonra TMV-parçacıkların genişliği Göreli dağılımı. (Uzunluk / genişlik ortalama ± standart sapma) değerleri ortalamaları 100 virionlar hesaplandı.