구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

1. 셀 라인, 벡터 건설과 Lentiviral 제작 인간의 머리와 목의 종양 세포 라인 (OSC19 또는 UMSCC1) 10 % 태아 소 혈청 FBS (Hyclone 고양이 # SH30070.03), 1 % 페니실린과 보충 (Cellgro 고양이 # 50-003 – PB) DMEM으로 구성된 완벽한 매체 교양되었습니다 / 스트렙토 마이신 (Cellgro 고양이 # 30-002 – CI), 1 %가 아닌 필수 아미노산 (Cellgro 고양이 # 25-025 – CI). pLL7.0 lentiviral 벡터로 LifeAct – mCherry 코딩 순서를 전송하기 위해 cDNA 부모 mCherry에 Sbf1 인식 사이트는 사이트 이동 돌연변이 유발 (Stratagene 고양이 # 200518-5)를 사용하여 인식 순서로 3 자동 변이를 도입함으로써 변경되었습니다. 그 결과 수정된 LifeAct – mCherry 순서는 다음 PCR은 EcoR1/Sbf1 사이트를 측면과 증폭 및 pLL7.0 – LifeAct – mCherry 구조를 생성하는 pLL7.0에 subcloned되었습니다. 2. pLL7.0 – LifeAct – mCherry 바이러스 생산 바이러스성 생산은 Lentiviral 표현 시스템 매뉴얼 (시스템 Bioscience 버전 2-051018)에 따라 실시되었다. 포장 세포주 293T/17 세포 (ATCC 고양이 # CRL – 11268) HNSCC 라인에 사용된 것과 같은 완전한 미디어 40 % 합류로 성장했다. 전지는 각각 (Clontech 고양이 # 631312) CalPhos를 사용하여 pLL7.0 – LifeAct – mCherry, psPAX2 및 3시 2분 1초 비율 pVSV – G 벡터와 transfected되었습니다. 24 시간 후에, transfection의 초기 미디어가 새로운 미디어로 대체되었습니다. 미디어 다음 수집 보충함 매 12 시간 72 시간 4 ° C.에 저장된 3. 안정 LifeAct – mCherry의 표정으로 머리와 목은 세포 라인의 생산 수집된 미디어 4 10 분 2,000 RPM에서 건지 알고 있느냐 ° C. 바이러스를 포함한 명확히 미디어 중 하나 ML 직접 12 시간 OSC19 또는 UMSCC1 세포에 추가되었습니다. 전지는 다음 씻어서되었고, 바이러스의 추가 한 ML은 다른 12 시간 동안 추가되었습니다. 세포는 강한 식민지를 선택하는 두 주 동안 200mg/ml puromycin를 포함하는 매체와 치료를했다. 살아남은 클론은 형광 현미경으로 LifeAct – mCherry 표현에 대한 시각 상영되었다. 개인 긍정적인 식민지는 무균 3mm 복제 디스크 (피셔 고양이 # 0790710A)를 사용 typsinized되었습니다. 긍정적인 세포는 다시 냉동 또는 orthotopic 사출에 사용까지 200mg/ml puromycin를 포함하는 미디어를 유지했다. 4. Orthotopic 종양 이종 이식의 형성 모든 동물의 절차는 웨스트 버지니아 대학 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 프로토콜 (09-0821)에 따라 실시되었다. LifeAct – mCherry 표현 종양 세포는 trypsinized centrifuged 및 2.5 X 10 4 세포를 50 μL 전체 미디어 resuspended 하였다. 종양 세포는 27에 연결된 한 ML 주사기 ½ 바늘에로드되었습니다. 여성 athymic Fox1 뉴 / 뉴 생쥐 연령 8 주 (할란 연구소)는 마취제와 10mg/kg xylazine을 80mg/kg의 조합 anesthetized되었습니다. Anesthetized 생쥐는 가열 패드에 37-40 ° C 사이에서 유지되었다. 멸균 집게를 사용하여 혀끝을 부드럽게 쥐었다 조심스럽게 구강 밖으로 뽑았습니다. 세포 천천히 언어 동맥을 피하기 위해, 혀 중앙에 주먹코 미사를 만드는 각각의 혀가 한쪽으로 주입되었다. 마우스는 2.1mg/kg의 최음제 (요힘빈)와 함께 주입하고 그들이 마취에서 회복하는 동안 2~3시간에 대한 모니터링했던 손난로으로 반환되었습니다. 일단 부흥, 생쥐는 유전자 변형 부드러운 반죽 다이어트 (Bioserve 고양이 # S3472)이있는 무균 새장에 배치했다. 생쥐 2-3일 모든 무게와 종양 발병에 대한 시각 감시했다. 5. 전 생체내 이미징을위한 마우스 방언의 준비 다른 시간 지점 (일반적으로 2~4주 후 주사)에 종양을 품고 마우스는 이산화탄소 흡입에 의해 euthanized되었다. 방언은 추출 1X PBS로 씻어서 현지 취미 상점과 크기 8 바느질 바늘에서 monofilament의 바느질 스레드를 사용하여 기존의 파라핀 조직 포함 카세트의 한쪽 (StatLab 캣 # H104)에 붙어 있었다. 방언이 고정화되었다되면 전체 카세트 어셈블리는 30mm 조직 문화 요리에 위치하고 1X PBS에 열중했다. 가공 방언은 즉시 두 광자 여기 현미경에 사용되었습니다. 6. 두 광자 현미경과 혀 종양의 영상 텅 카세트는 직립 현미경 (; 서터 악기 움직일 수있는 현미경 (MOM))의 목적에 따라 위치 개폐식 캔틸레버 암 (상공 회의소 셔틀, 시스키유 악기)에 맞춤 설계된 소지자의 보안 1X PBS를 포함 60mm 접시에 빠져들되었다. 40X/0.8NA 물 수영 객관 렌즈는 가시 텀에 이상 직접 배치했다또는 병변. 사파이어 레이저 (미라, 일관된) 60 MW와 755 nm의 파장의 입력에서 강도 mCherry 신호를 최적화하기 : 방언은 티로 두 광자 현미경으로 몇 군데 있었다. 시리얼 1mm 레이저 스캔 이미지 15 및 100 μm의 (종양 부피에 따라) 사이의 전체 조직이 깊이 대 1 μm의 증분 깊이에서 수집된 있었다. 이미지 ScanImage, 카렐 스보보다 실험실 (Janelia 팜, HHMI)에 의해 개발된 MATLAB 플랫폼을 기반으로 오픈 소스 프로그램을 사용하여 점령했다. ScanImage는 X / Y 갈바 스캔 미러를 제어하는​​ 래스터 스캔 패턴의 2 채널 출력을 생성하고, 동시에 (PCI – 6610S 데이터 수집 보드를 통해 photomultiplier 튜브 (PMTs)에서 동시에 최대 4 채널의 신호 입력을 캡처 , 내쇼날 인스 트루먼 트). PMT 신호는 모니터 화면에 표시를위한 NI – DAQ 보드에 이송하기 전에 저소음 현재 preamplifiers (SR570, 스탠포드 연구 시스템)에 의해 증폭됩니다. ScanImage은 목표의 Z 축 제어를하여 Z – 스택 이미지를 수집하고 단일 또는 사이클 모드에서 시간 경과 이미지를 수집합니다. 이미지는 16 비트 깊이로 단일 TIFF 파일에 저장되었습니다. 7. Amira 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석 종양 부량에 대한 Amira 이미징 : Aimra 소프트웨어에서 Z – 스택 이미지의 집합을 포함하는 TIFF 파일을 엽니다. 파일 이름을 강조 표시, 선택하고 입체 렌더링을 생성하는 Voltex 기능을 적용할 수 있습니다. 이하 침략 세포의 여러 작은, dissociated 침해 그룹 (IG)와 큰 차 종양 이미지 (그림 6A 참조) 렌더링된 이미지에 일반적으로 분명합니다. 기본 종양의 질량을 선택하려면 다음 다음 "레이블 필드를" "레이블", "오픈 데이터"를 선택하십시오. 기본 Thresholding 모든 Z – 스택 이미지를 종양 것은의 선택과 세 차원에서만 기본 종양의 질량 포함을 보장하기 위해 Z – 비행기의 이미지를 스크롤합니다. 이것은 일반적으로 현장에서 가장 큰 크기의 이미지와 몇 군데가 Z – 비행기를 통해 통과와 같이 자주 세그먼트가 나타납니다. 배경 형광을 수정하고 폐기 종양 신호의없이 이미지에서 그것을 제거하는 마술 지팡이 / 임계값 기능을 사용하십시오. "내부 파일"레이블을 강조 표시하고 ⊕ 버튼을 클릭합니다. "모든 조각"확인란을 선택합니다. 이것은 모든 Z – 스택 증가에 thresholded 기본 종양 주변 색 테두리를 생산하고 있습니다. IGS를 선택하려면, "새"기능을 선택합니다. 단일 IG을 선택하고 그것이 Z – 비행기 스크롤하여 기본 종양과 관련되지 않도록. "모든 조각"을 선택하고 ⊕ 버튼을 클릭합니다. 파일 (IG 1 예)을 이름 바꾸기 7.4에서 thresholding 절차를 반복하여 결정 IG에 대해 7.5의 하이라이트 단계. 기본 종양의 질량을 나타내는 데 사용되는 색상과 다를 외곽선 색상을 선택합니다. 모든 IGS가 표시됨 수 있도록하는 Z – 비행기를 통해 스캐닝, 이미지를 통해 각 추가 IG에 대해 필요한 반복합니다. 이미지를 미래의 식별에있는 각 식별 IG 에이즈에 대해 서로 다른 색상을 사용합니다. 기본 종양 모든 IGS이 선택되면, 풀다운 메뉴에서 "분할"을 선택 후, '물질 통계 "를 선택하십시오. 이것은 볼륨의 측정뿐만 아니라 X, Y 및 X 종양 코어는 중앙 종양 지점에서 IGS의 거리를 계산하기 위해 기본 종양에 대한 좌표를 제공합니다. 볼륨 계산을 통해 기본 종양의 중심 코어에서 각 IG에 대한 거리를 결정합니다. 다음 '세그먼트', '자재 통계 "를 선택하십시오. 이 단계는 픽셀로 모든 측정을 계산합니다. 현미경 목표의 교정과 배율에 추가 증가 (; 줌 기능 IE)를 기반으로 micrometers에 픽셀을 변환합니다. 현미경 이러한 실험에 사용되는 설정에, 40X 목표는 1 픽셀 = 0.298 μm의의 교정을 제공, 아니 확대와 함께 사용되었다. 3 차원에 기본 종양 (X1, Y1, Z1) 및 각 IG (X2, Y2, 첫 번째 IG에 대한 Z2 예)에 대한 매개 변수를 제공 Excel 스프레드 시트로 가져오기 데이터입니다. 기본 종양의 중심에서 각 IG에 대한 미크론의 침략 거리는 공식 √ ((X2 – X1) 2 +를 (Y2 – Y1) 2 + (Z2 – Z1) 2)를 사용하여 계산됩니다. 종양 침입 색인 (T I) 수식 T I = N T X V T X D T, N T = 이미지에 IGS의 총 개수, V T = 모든 IGS의 총 볼륨, D T를 사용하여 계산됩니다 = 총 거리는 기본 종양의 중심에서 모든 침략적 그룹 여행. 8. 니콘 NIS – 요소 소프트웨어와 입체 렌더링 큰 지형 세부 사항과 함께 입체 렌더링은 니콘 NIS – 요소 소프트웨어로 전체 종양 이미지의 원본 16 비트 흑백 TIFF 파일을 가져와서 생성할 수 있습니다패키지 (니콘, 멜빌, NY). 다음 "ND"를 "파일"을 선택한 다음 "파일 시퀀스에서 ND 파일 만들기". TIFF Z – 시리즈 이미지 스택을 선택하고 해당 단계의 크기를 지정합니다. XY 평면에서 ND 문서를 보정합니다. 수동 보정을 사용하여 한 픽셀의 크기를 지정합니다. "볼륨보기"를 선택합니다. 높은 품질 Z – 비행기에 추가 조각을 계산하려면 "HQ"기능을 사용하십시오. "3D 렌더기 설정"에서 "초고 세부 사항"과 "전체 해상도"의 품질 "고급 렌더기"를 사용합니다. 종양 표면을 강조하기 위해 '알파 블렌딩 "을 선택합니다. 프레 젠 테이션에 대한 3 차원 이미지를 최적화합니다. 종양 및 관련 IGS하며 필요에 따라 작물에 확대. XYZ의 비행기에서 이미지를 회전하고 LUTs를 조정합니다. 프레 젠 테이션에 대한 이미지를 캡처합니다. "편집 – 만들기보기 스냅샷 (8 비트 RGB)"를 선택하십시오. 이름과 그에 따라 파일을 저장합니다. 9. 대표 결과 그림 1. orthotopic 혀 종양 생산과 현장이 광자 이미징의 주요 단계를 설명하는 전체 설계도. 그림 2. 마우스 혀를에 OSC19 세포를 표현 LifeAct – mCherry의 사출. 그림 3 Resected 종양 함유 마우스 혀가 두 광자 이미징을위한 준비. 그림 4. 이미징 준비 두 광자 현미경의 위치에 종양이 함유 혀가의 오리 엔테이션. 그림 5. ScanImage은 초기 두 광자 이미지의 원시 데이터 수집을 보여주 쏜 대표 화면. 그림 6. orthotopic OSC19 종양의 이미지 분석 및 종양 침략의 부량. Amira Voltex 렌더링 (A)와 하나의 thresholded Z – 섹션 대표 스크린샷 이미지가 (B) 기본 기본 종양과 파란색으로 설명 자주색, 침략 그룹 1 (IG – 1)에 명시된, IG – 2는 빨간색 IG에 명시된 -3는 식별 절차의 예를 들어 녹색으로 설명했다. 화살촉이에 IGS을 나타냅니다 (A)와 (B). 볼륨 C. 플로츠 대 종양 침공 지수 (TI)를 계산하는 데 사용 여덟 개인 IGS에 대한 거리를 침공. 그림 7. 대표 종양의 이미지 및 기존 IHC 접근에서 이미지와 비교하여이 프로토콜에서 종양 그룹을 침공. UMSCC1 orthotopic 종양을 품고 전체 마우스 혀 A.의 파라핀 섹션. Immunohistochemical 얼룩은 HNSCC 특정 세포 마커 emmprin (Zymed, 고양이 # 34-5600)에 대한 기본 항체와 함께 종래의 절차를 사용하여 실시되었다 1:1000 희석에서와 OmniMap DAB 안티 – RB ​​탐지 키트 (벤타나 고양이 # 760을 사용하여 시각 -149)는 철분 hematoxylin의 얼룩으로 따라갔다. 전체 혀 영역을 포함한 이미지 Optronics MicroFire CCD 카메라와 올림푸스 ZX70 비스 현미경에 4X 배율에서 개별적으로 수집하고 StereoINvestigator 이미징 패키지 (MBF Bioscience)를 사용하여 복원되었습니다. 종양은 혀 끝에 분명하다. 침입 앞면과 개별 종양 세포 그룹 (화살촉)을 보여주는 확대 지역은 대표적인 OSC19 종양의 (B). C. 니콘 NIS – 요소 렌더링에 표시됩니다. 향상된 윤곽 세부 사항 및 IGS 명확하게 시각화가 (화살촉) 분명하다. 모든 이미지 바 = 100 μm의.