מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי
Summary
הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.
Abstract
מטריקס קשיחות מאוד משפיע, צמיחה בידול ותפקוד של תאים חסיד 1-3. בסולם המאקרו את הנוקשות של רקמות ואיברים בגוף האדם תוחלת צווים שונים של גודל 4. הרבה פחות ידוע על כמה קשיחות משתנה מרחבית בתוך רקמות, ומה היקף בקנה מידה נוקשות של שינויים מרחביים הם תהליכי מחלה כי התוצאה שיפוץ רקמות. כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים נוקשות מטריקס לתרום הפיזיולוגיה הסלולר מחלה ובריאות, מדידות של רקמות נוקשות שהושגו בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב נדרשים. זה נכון במיוחד עבור הריאות, רקמה תואם מאוד אלסטי בו שיפוץ מטריצה היא תכונה בולטת במחלות כגון יתר לחץ דם אסטמה, אמפיזמה פיברוזיס. כדי לאפיין את הסביבה מכני מקומי של הריאות parenchyma בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב, פיתחנו שיטות כדי למדוד ישירות את המאפיינים אלסטי מקומית של רקמת הריאה טרי Murine באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) microindentation. עם הבחירה המתאימה של AFM Indentor, שלוחה, ועומק הכניסה, שיטות אלה מאפשרים מדידות של מודולוס גזירה מקומית ברקמת במקביל בניגוד שלב ו דימות פלואורסצנטי האזור של עניין. דגימה שיטתית של רצועות ורקמות מספק מפות של מאפייני רקמת מכני החושפים שינויים מרחביים המקומית מודולוס גזירה. מתאמים בין תכונות מכניות תכונות אנטומיות ופתולוגיים הבסיסית להמחיש כיצד קשיחות משתנה עם מטריקס ב סיסטיק בתצהיר. שיטות אלה ניתן להרחיב את רקמות רכות אחרות תהליכי מחלה לחשוף כמה תכונות מכניות רקמות מקומיות שונות ברחבי החלל התקדמות המחלה.
Protocol
Discussion
אפיון מכני של רקמת הריאה באמצעות AFM microindentation מציע ברזולוציה מרחבית חסרת תקדים (איור 4), המספק נקודת מבט ייחודית על וריאציות microscale ב קשיחות הרקמה. כדוגמה השירות שלה, הקודם מאקרו בקנה מידה מדידות רצועות רקמה נורמלית fibrotic ריאות הצביעו על עלייה משוער 2-3 של פי elastance עם סיסטיק 11,12. לעומת זאת, microindentation AFM מגלה כי התקשות רקמות הוא מקומי מאוד, עם אזורים מסוימים מציג עד ~ מגדיל פי 30 ב מודולוס גזירה מעל החציון שנצפתה רקמת הריאה נורמלי 10. כמו נוקשות מטריצה כיום ידוע באופן ביקורתי להשפיע על תפקוד התאים, המדידות הללו המקומית לספק פרמטרים שלא יסולא בפז כדי לשפר את biofidelity המחקר התא התרבות של תאים הריאות.
כמה עולות סוגיות מעשיות לשימוש רצועות דקות של רקמת הריאות. משטחים של רצועות אינם שטוח לחלוטין, כמו פרופיל רקמות בעקבות הארכיטקטורה של alveoli הבסיסית. מערכת AFM באופן אוטומטי את מיקום קצה בכיוון-Z במהלך הכניסה כאשר פני השטח מדגם וריאציה גובה קטן מ -15 מיקרומטר כדי לסייע להתגבר על האתגר הזה. המדידות נעשות בטמפרטורת החדר, לא 37 ° C, ולכן סטיות של תכונות מכניות הנגרמת על ידי וריאציה זו בטמפרטורה לא ניתן להעריך, אם כי הם יהיו צפויים להיות קלים. השפעת הארכיטקטורה שבבסיס קיר מכתשיים על תכונות מכניות נצפתה קשה לקבוע עם ההגדרה הנוכחית במיקרוסקופ אור. למשל, רצוי לקבוע אם הקירות מכתשיים התערוכה אנאיזוטרופיה תכונות מכניות שונות כאשר מסוכסך בכיוונים מיושר עם או רוחבי למישור הקיר. עם זאת, דגימות הנוכחי עבים מערכת הדמיה אין יכולות 3D, ולכן לא ניתן לקבוע את הכיוון המקומית קיר מכתשיים בכל נקודת מגע. לבסוף, את השפעתם של מרכיבים הסלולר על תכונות מכניות נמדד עדיין לא הובהר באופן מלא. בכל השיטות המפורטות כאן, המאמצים לא נעשים במפורש להסיר מרכיבים הסלולר של הרקמה. עם זאת, התאים את ההווה על פני השטח זמין עבור הכניסה צפויים להיות בת קיימא לנוכח הזמן שחלף מאז הקציר רקמות הצורך חיתוך הרקמה כדי לקבל גישה alveoli. ניסויים ספציפיים כדי להסיר תאים או לאכלס מחדש מטריצות עם תאים קיימא, ולהעריך את השינויים וכתוצאה מכך קשיחות הרקמה יופיע מוצדקת.
מכיוון רקמת מבולבל טרי דרוש מדידות אלה, הזמן שחלף מן הקציר רקמות מדידה צריך להיות ממוזער דגימות צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע שינויים תכונות מכניות. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם בכל פעם רצועות ורקמות מועברים בין המכולות במהלך הכביסה או מכתים כך עיוות נזק מינימלי או מופק. עבור יישום AFM בנוזל, היא צעד חיוני כדי לחתוך את הרקמה כפי שטוחה ככל האפשר לשתק את המדגם על coverslip התומכת. אם זמין, מכונת חתך אוטומטי כגון vibratome או מבצעה רקמה ניתן להשתמש כדי לחתוך פרוסות בעובי אחיד מאוד. חשוב לצרף רצועות רקמה מיד לפני מדידות AFM ולמזער את הזמן שחלף עבור מדידות AFM כמו המדגם יהיה בסופו של דבר להתנתק coverslips. תצפית אחת שימושית כי רצועות גדול להופיע לצרף ביציבות יותר כדי לכסות את תלושי להישאר במקום משכי זמן של PBS מאשר רצועות קטנות יותר.
Microindentation AFM ניתן לאפיין דגימות פורש מגוון רחב של אבא 100 עד kPa 50 (גזירה מודולוס) בעת שימוש 0.06 תקן N / שלוחה מ 'עם טיפ 5 מיקרומטר קוטר כדורית. טווח זה ניתן להרחיב באמצעות בדיקות עם קבועי קפיץ שונים; בדיקות AFM עם טיפים זכוכית כדורית החל 0.6-12 מיקרומטר קבועים בקוטר האביב החל 0.01-0.58 N / m זמינים מסחרית (לדוגמה Novascan) ו נפוץ 3. עם קצה כדורי 5 מיקרומטר, האזור קשר תיאורטי בין עצה לבין רקמות היא כ 5-9 מיקרומטר 2 עבור הכניסה 400-700 ננומטר (איור 1A). טיפים קטנים יותר או גדול יותר יכול לשמש כדי לספק סולמות קטן או גדול של רזולוציה מרחבית. טיפים פירמידה יש גם בשימוש microindentation AFM 13-16, מתן מגע באזורים קטנים יותר ובכך להגדיל רזולוציה מרחבית במיפוי, אם כי ראוי נתונים מורכב יותר עבור הגיאומטריה טיפ זה.
מספר מגבלות לשיטה זו יש לציין. הריאות באופן מסורתי מאופיין מכנית הלא פולשני, למשל באמצעות הלחץ בנפח 17 או ניתוח פונץ הכניסה של הריאות כל 19,20. שיטות פולשנית כמו זה המתואר כאן לשנות את הארכיטקטורה ריאות במובנים חשובים דרך אובדן int אוויר הנוזלerface כי בדרך כלל קיימת הריאות אוויר מילאו את ואובדן להדגיש מראש כי האינפלציה שומרת ריאות חלקית על הרפיה של שרירי הנשימה. מגבלות אלה משותפת לכל המדידות שנעשו רקמת הריאות 18 רצועות. יש לציין, עם זאת, נוקשות החציוני הנמדד parenchyma של רקמת הריאה נורמלי (מודולוס גזירה ~ 0.5kPa) לא שונות באופן מהותי מן אומדנים המבוססים על הכניסה-אגרוף של הריאות שלם בעוצמות מנוחה 19,20. בעוד רקמת הריאה ידוע התערוכה שאינו ליניארי התקשות עם העיוות גדל, לא ניתן לבדוק באופן קפדני אם נכס זה נמשכת עד בקנה מידה מיקרו עם השיטות הננקטות כאן. המודל מניח הרץ ההומוגניות של המדגם. עם זאת, חומרים ביולוגיים ביותר, כולל ריאות parenchyma, הם הטרוגניים יותר ויותר ירידה קשקשים מרחבית. ההטרוגניות של המדגם יכול לגרום חפצים כמו וריאציה של מודול של יאנג, תלוי בעומק הכניסה, כלומר בהתאם השכבה או רכיב זה עיוות. ההטרוגניות במישור xy, יכול להיות מוגבל על ידי בחירה מדוקדקת בגודל המתאים קצה כדוריים בהתאם מיקרו של ביולוגי כפי שהוצע על ידי Dimitriadis EK et al. 8 זה הרבה יותר קשה לחזות או לתקן את השגיאה מודל הרץ בשל חומר ההטרוגניות בכיוון-z. Azeloglu et al. לאחרונה הציע מודל חישובי היברידית לאפיין את תכונות אלסטיות של המצע הטרוגנית עם תכלילים מוטבע בדידים 21. הטכניקה החדשה שלהם מספק פוטנציאל אמצעי כדי לחשב תכונות הכללתם של חומרים הטרוגניים להתגבר על המגבלות של ניתוח Hertzian.
המודל מניח הרץ גם התנהגות אלסטית מוחלטת, בעוד חומרים ביולוגיים בדרך כלל להציג תלוי זמן התנהגויות viscoelastic. אפיון viscoelastic מלא של רקמה ניתן להשיג על ידי שינוי מהירויות הכניסה בשימוש. חשוב לציין, בדיקות קודמות מאקרו בקנה מידה מכנית של רקמת הריאה נורמלי fibrotic מדגים תלות תדר חלש של רקמת הריאה תכונות מכניות, ושמירה על ההבדלים בין מאפייני רקמת נורמלי fibrotic מכני על פני תדרים כל נבדק 11. ממצאים אלו ממליצים כי מדידת תכונות מכניות באמצעות מהירות הכניסה יחיד עם AFM לוכדת היבט חיוני של שינויים במאפייני הרקמה מכני שמלווים פיברוזיס.
היחס של פואסון של 0.4 עבור רקמת הריאה המשמש עבודה זו היא מן מדידה מאקרוסקופי 9. למרבה הצער, יחס של פואסון על מיקרו בקנה מידה שינויים בתנאי המחלה אינם זמינים בספרות. כפי חלופות E, E / (1-υ 2) או (1-υ 2) / πE (סימלה את k קבוע אלסטי) 22 ניתן לחשב microindentation AFM ודיווח כאשר היחס של פואסון אינו ידוע. עבור רוב biomaterials היחס של פואסון הוא בטווח של 0.4-0.5 בגלל תכולת המים הגבוהה שלהם. בטווח 0.3-0.5, הגורם 1 / (1-υ 2) משתנה רק 1.10-1.33, כך וריאציות סביר ביחס של פואסון להפעיל רק תופעות צנוע על מודול דיווח. הגידול מודולוס גזירה שאנחנו הדוח היחסית רקמות fibrotic אל הרקמות הוא פי כמה גודל, רומז כי השגיאות המשויכות וריאציות של יחס פואסון הם קלים יחסית לשינויים שנצפו תכונות מכניות.
האלגוריתם קוד בפועל שיכול לשמש לניתוח נתונים עקירה בכוח כפוף לתנאי היישום הספציפי ואת המאפיינים הבאים של אוכלוסיות מגוונות של עקירה בכוח עקומות. אם ניתוח מתוחכם יותר מעניין, אפשר להתייעץ העבודה של Lin et al. 23. החוקרים ערכו סדרה של אסטרטגיות סינרגיסטי לתוך אלגוריתם מתגבר רבים של סיבוכים אשר מנע בעבר מאמצים כדי להפוך את הרץ הולם של מודלים של נתונים הכניסה.
בתחומים אחרים קיימות מספר לפיתוח ניצול נוסף של שיטה זו. במקרים שבהם אחד הוא מעוניין לדמיין את קירות מכתשיים ללא תיוג נוגדן, הן קולגן ואלסטין ו ניתן דמיינו מן האות autofluorescent שלהם בספקטרום הירוק. מצד שני, הדמיה טובה יותר, או באמצעות קטעי רקמה רזה, שיטות הדמיה 3D, או שניהם, יכול לשפר את היכולת לקשר בין הארכיטקטורה הבסיסית רקמות עם תכונות מכניות. בעוד השיטות הקיימות ולאפשר מכתים ויזואליזציה של מרכיבי תאי מטריקס כגון קולגן laminin, מאמצים נוסף יכול להיות מכוון מכתים פני התא סמנים לזיהוי אוכלוסיות תאים ספציפיים כדי לאפיין את microenvironments מכני בקרבת אוכלוסיות כאלה. Alternatively, רקמה ניתן לקצור מעכברים להביע fluorescently-tagged השושלת סמנים או חלבונים ספציפיים בתא להמשיך את אותה המטרה. לבסוף, השיטה המפורטת כאן מופיע גם מתאים לאפיון תכונות אנטומיות אחרות בריאה, כגון כלי אשר לשפץ ב יתר לחץ דם, ואת דרכי הנשימה אשר לשפץ באסתמה. בהתבסס על המצב הנוכחי של פיתוח פוטנציאל שיפור נוסף, microindentation AFM מופיע צפוי להניב תובנות רבות ערך את השינויים רקמות נוקשות שמלווים התקדמות המחלה בריאה, יהיה ללא ספק להיות בעל ערך באפיון שינויים במרחב ובזמן ב קשיחות של מגוון רחב של רקמות רכות אחרות.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים תג'ר א 'וב' שיאה של שיתוף הפעולה המתמשך שלהם, לצורך מתן רקמת הריאה למטרות הדגמה כאן. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק HL-092961. עבודה זו בוצעה כחלק במרכז מערכות ננומטריות (CNS), חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות, אשר נתמך על ידי קרן המדע הלאומית תחת הפרס NSF ECS-0335765. CNS היא חלק מהפקולטה למדעים ואמנויות באוניברסיטת הרווארד.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
| Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
| Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
| Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
| Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |
References
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains. J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).
- Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers. Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).
- Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).
- Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. Poissons’ ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi. Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).
- Liu, F. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).
- Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects. Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).
- Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).
- Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. Cell responses to the mechanochemical microenvironment–implications for regenerative medicine and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).
- Berry, M. F. Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).
- Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness. J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).
- Wagh, A. A. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).
- Martinez, F. J., Flaherty, K. Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias. Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).
- Cavalcante, F. S. Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue. J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).
- Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung. J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).
- Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. Elastic constants of inflated lobes of dog lungs. J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).
- Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).
- A-Hassan, E. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).
