Induction et les essais de l'hypoxie en culture cellulaire

1. L'hypoxie induite par CoCl 2 solutions Hexahydrate de chlorure de cobalt (II) (CoCl 2 • 6H 2 O, MO = 237,9) est un inducteur chimique de hypoxia-inducible factor-1.3 8. Ce produit est soluble dans l'eau (100 mg / ml), ce qui donne une solution claire, rouge. Préparer une solution stock de 25 mM jj eau stérile, (préparer immédiatement avant utilisation) Utilisez CoCl 2 à la concentration finale de 100 microns dans votre réguliers milieux de culture cellulaire pour induire une hypoxie. Ajoutez les 2 CoCl support contenant vos cellules et incuber les cultures pour les 24 heures dans un incubateur conventionnelle (37 ° C, 5% C0 2). La concentration au-dessus fonctionne pour les lignées cellulaires, nous avons testé, mais chaque lignée cellulaire devrait être testé à différentes concentrations (d'établir une courbe dose-dépendante) ainsi qu'à différents temps d'incubation afin de limiter la toxicité des médicaments liés et d'optimiser le dosage. 2. L'hypoxie induit dans Modulaire Incubateur Chambre Préparer au moins deux cultures cellulaires identiques (double culture). Les cultures cellulaires peuvent être dans des flacons, des plaques ou des boîtes de culture. Pour ouvrir la chambre, ouvrez tout d'abord les deux pinces en plastique blanc situé sur les tubes attachés à la chambre (tubes utilisés pour l'injection / la purge du gaz hypoxique) et ouvrir doucement la pince anneau en acier. Communiqué de la pince. Le couvercle et les plateaux peuvent maintenant être supprimés. Placez la culture de cellules dans la chambre hypoxique. Également placer une boîte de Petri contenant de l'eau stérile dans la chambre pour procurer une humidification adéquate des cultures. Placer la culture "jumeau" de cellules en normoxie comme contrôle. Assurez-vous que les plateaux sont sécurisés et ne bouge pas, et puis fermer la chambre avec son couvercle. Positionner correctement le collier bague en acier pour assurer la fermeture hermétique de la chambre et le fermer. Pour créer une hypoxie, fixez le tuyau d'un «réservoir d'hypoxie" contenant un mélange de 1% O 2 du gaz. Si vous avez un compteur de débit connecté à votre réservoir de votre chambre sera directement relié à celui-ci (citerne de gaz à débit mètre de chambre). Nous utilisons un débitmètre incorporé dans notre régulateur. Il est important pour la plupart, sinon tous retirer l'oxygène présent dans la chambre et dans vos médias, de le faire rincer la chambre en ouvrant le réservoir de gaz à un débit de 20 litres par minutes pour les 7-10 minutes, puis éteindre rapidement la débit de gaz et de fermer complètement la chambre en fermant deux colliers blancs. Retour dans la chambre à une installation classique incubateur pour la période de temps désirée. Si vous utilisez de grandes cultures, permettre aux médias dans les cultures à dégazer pour 1 – 2 heures, puis répétez rincer. Les étapes ci-dessus sont basées sur les recommandations du constructeur (Billups-Rothenberg, Inc). Assurez-vous du réservoir de gaz sont correctement sécurisés à tout moment. Notes: Afin d'éliminer l'O 2 contenu dans les médias, il est conseillé de re-gaz de la chambre une fois après 1-3 heures. Pour le temps d'incubation plus longue que 48 heures, il est également conseillé de re-gaz de la chambre. Les capteurs d'oxygène (électrodes / manomètre) qui permettent des mesures de la O 2 contenu dans les cellules / chambre va fournir une mesure plus précise de l'O intracellulaire / chambre 2 contiennent). La culture de cellules à des longueurs différentes de temps pour faire un temps courbe permettrait de déterminer l'expression du temps optimal de HIF-1α dans vos cellules particulières. 3. Evaluation de l'hypoxie HIF-1 α la détection par Western blot. Re-ouvrir votre chambre comme décrit dans la section 2.2 et placer immédiatement vos cultures sur la glace. Lyse hypoxie cellules traitées et non traitées avec une solution de SDS à 5% dans les assiettes, puis transférer le lysat cellulaire à des tubes, soniquer, spindown les débris cellulaires et recueillir le surnageant. Mesurer la concentration de protéines en utilisant kit BCA, préparer l'échantillon par addition de tampon de chargement et de chauffage à 95 ° C pendant 5 min. Electrophorèse des protéines sur un 8% gel SDS-polyacrylamide et le transfert des membranes de nitrocellulose. Bloc de la membrane dans du PBS contenant 5% non gras du lait en poudre et 0,1% de Tween 20 à la température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit sur le shaker. Nuit avec des anti-HIF-1α anticorps monoclonal primaire (1 / 600) dans le même tampon immunoblot à 4 ° C. Laver 3 fois en PBS contenant 0,1% de Tween 20 à la température ambiante, 5min à chaque fois et incuber avec HRP-anticorps secondaire (1 / 2000) dans du PBS + 0,1% Tween 20 pendant 45 min. Laver 3 fois en PBS contenant 0,1% de Tween 20 à la température ambiante, 5min / heure. Utilisez Pierce ECL kit et X-ray du film pour montrer la bande protéique L'hypoxie responsive element (HRE). HIF-1α régule de nombreux gènes (c.-VEGF, OEB) en se liant à une séquence appelée hypoxie élément régulateur (HRE). En utilisant l'EDH associé à un gène marqueur it est possible de détecter l'activité de HIF 9. Pour utiliser cette méthode, vous devez d'abord vous transfecter des cellules avec un plasmide HRE-luciférase en utilisant une méthode de transfection adapté à vos cellules. Par exemple, nous avons utilisé Lipofectamine 2000. Les cellules transfectées ont besoin d'être au moins 4 heures avant d'être incubés dans l'hypoxie et normoxie. Ce temps permet à l'ADN de pénétrer dans les cellules de sorte que cette première étape n'est pas affecté par l'hypoxie. Le signal de la luciférase est détectée en utilisant un kit Luciferase Assay. Incuber votre EDH cellules transfectées en hypoxie dans la chambre modulaire ou l'utilisation de cellules transfectées HRE-incubées avec CoCl 2, comprennent un contrôle normoxie. Après la période d'incubation désirée, retirez le milieu de croissance des cellules. Rincer les cellules dans du PBS, enlever le CPE. Distribuer 400μl de réactif de lyse 1X dans un plat à la culture et racler les cellules attachées, puis les transférer dans un tube de micro. Des débris par centrifugation brève. Mélange de 20 pi lysats cellulaires surnageant avec 100 pi de réactif de dosage luciférase et de mesurer la luminescence en utilisant un luminomètre. 4. Les résultats représentatifs: Dans les cellules K562 (lignée cellulaire humaine de leucémie) cultivées dans les deux jours en oxygène est faible, par rapport à la normoxie, hypoxie induit une augmentation de HIF-1α protéine qui a été détectée par western blot (figure 1). Utiliser HRE-luciférase modifiée 293 cellules (embryonnaires lignée cellulaire de rein) cultivées en hypoxie, une augmentation significative de HIF-1α activité n'a été détectée dans les cellules hypoxiques (Figure 2). Figure 1: Augmentation de HIF-1α dans les cellules hypoxiques. K562 ont été la culture en normoxie et hypoxie (chambre hypoxique) pendant 48 heures et analysés par western blot utilisant un anticorps spécifique de HIF-1α. Un anticorps spécifique de l'actine a été utilisée pour le contrôle du chargement. Figure 2: HIF-1α activité. HRE-luciférase modifiée 293 cellules ont été cultivées en hypoxie et normoxie pendant 48 heures puis lysées pour détecter le signal luciférase en utilisant un kit de dosage de la luciférase et un luminomètre. Les résultats sont exprimés comme l'unité de luminescence relatives (RLU).