微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

1。マウスボード、筋肉の台座、本体のウェッジと灌流液マウスボード：透明な長方形のプレキシグラス板は（6"ワイドX 8"長いX 3 / 16"厚さ）顕微鏡のステージに収まるように作られています。"麻酔マウスがの手術の準備中に確保されている場所にマウスボード"が精巣挙筋。 筋肉の台座：透明なシラスティックゴム台座は、メーカー° Sの指示にしたがって混合してSylgard 184、から調製される。便利な金型は15 mm厚× 50 mmの直径の直径使い捨てペトリ皿で​​す。 Sylgardのブロックは、かみそりの刃（図1Cを参照してください。）で所望の形状にカットされます。透明な防水シリコーン接着剤の薄層は、マウスボードにSylgardのブロックを保護するために使用されます。役に立つヒント：時間のための真空チャンバ内で脱ガス、ペトリ皿にSylgardを注入後の気泡を除去し、透明性を向上させる。 Sylgardのための時間が50 ° Cで数時間のために実験室のオーブンに皿を置くことによって短縮された硬化、脱気の後。 体のくさびと加熱プラットフォーム：マウスの​​下にと台座に対する位置付けウェッジ（2"X 4"X 15 °）は、その原点から台座を介して精巣挙筋を拡張容易前方に体を傾斜させる。表面にアルミのプラットフォームを組み込むことにより、導電性の熱を提供します。プラットフォームは、DC電源装置（図1A）に接続された抵抗によって加熱される。プラットフォームの温度をキャリブレーション〜40 ° C〜37食道温度を維持℃にそうでない場合は、ランプからの輻射熱が使用されます。 ピン。台座の精巣挙筋を確保するために、ピンは"L"の形に曲げられている0.15ミリメートルの昆虫ピンから調製される。 生理食塩水（PSS）。製剤は、超高純度（MΩ18.2）H 2 Oで調製された重炭酸塩-緩衝PSSで連続的に（灌漑）灌流されていますストック溶液は20倍、最終的な作業濃度で調製し、0.2μmのフィルターを通して滅菌する。 4℃で保存した場合、ストック溶液は、数週間のための良いまま重炭酸塩とは別に塩を準備し、実験当日に希釈してこれらを組み合わせて使用​​すると、重炭酸カルシウムの沈殿を防ぐことができます。株式の塩の溶液（ミリモル/ Lで）で構成されています：2638のNaCl、94のKCl、40 MgS0 4、23.4 CaCl 2を 。株式の炭酸は360のNaHCO 3です。実験日に、それぞれのソリューションは、メスフラスコで最終容量（通常は特定の実験のための2リットル）に運ばれ、〜37℃の水浴に入れ5％CO 2でPSSを平衡化/ガス分散器を用いて〜15分間95％のN 2〜7.4にpHを調整し、沈殿を防ぐことができます。 PSSは、5％CO 2 /実験を通して95％のN 2で連続的にバブリングする。最終的な作業溶液組成は、（ミリモル/ Lの）です：132のNaCl、4.7 KClを、1.2 MgS0 4、2のCaCl 2、18のNaHCO 3。 2。麻酔と手術の準備動物実験用の委員会の承認に続いて、少なくとも12週齢の雄マウスが使用されます。マウスは、腹腔内（ip）注射を介してペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）で麻酔です。拘束チューブは最初の注射の間は、マウスを確保するための有用証明する。外科的処置および実験的なプロトコルを通じて、麻酔は必要に応じてサプリメント（最初の注射の10-20％は、ip）（;つま先や尾のピンチに撤退の反応によって示される毎に30〜60分）によって維持されています。ヒント：注入が過剰摂取の可能性を軽減する前に滅菌生理食塩水にペントバルビタール10 mg / mlのを希釈。 マウスはすぐに最初の注射後に保温されている必要がありますので、麻酔は、体温調節が損なわれます。加熱プレートの上に（換気アルミバスケット）は、金属製のフレームにマウスを置く（〜37 ° Cに校正された）うまく動作します。また、熱のランプは、マウスから適切な距離でそれを配置することに注意しながら使用することができます。麻酔の適切なレベルを（つま先やテールピンチに撤退の欠如）が達成されるまでマウスを5〜10分を監視する必要があります。補足投与量は15〜20分後に必要になることがあります。患者になると、特に肥満や老齢動物で、過剰摂取を避けるために慎重に進めるのが最善です。 髪の毛は、慎重にそれぞれの領域を削って下腹部、腰、陰嚢と脚から削除されます。特に注意が特に精巣挙筋を傷つけるだろう陰嚢と精巣への外傷を避けるために注意する必要があります。新鮮アルコール綿棒で抜け毛を削除します。 膀胱がいっぱいになっている場合には、腹壁を通って小さなブドウのように感じるでしょう。実験中にクレの準備に排尿からマウスを防ぐために穏やかな圧力を使用して膀胱を空にします。キムワイプはcollecに効果のスポンジです。トン尿。 その足は台座をまたいでくさびの上に横たわる、その背中にマウスを合わせます。各足に結び付けられて絹の縫合糸は、（4-0または5-0）台座に対して、その股間にマウスを保護するためのテザーを提供します。胸に緩く置かれたとウエッジに固定されたテープの部分は、全体のボディの位置を維持します。顕微解剖用はさみと角度の鉗子を用いて実体顕微鏡を通して見ながら外科手術が行われます。 3。オープン精巣挙筋の手術の準備ピンは、陰嚢の頂部（左側または右側）を介して配置され、皮膚の緊張を置く台座に固定されています。 PSS（34〜35 ° C）で灌流は、術野を介して開始され、曝露された組織は、暖かく湿った保つために解剖していても維持されます。陰嚢と真空ラインの他の隣の隣の一端に配置さ芯は（キムワイプで作られた）排水PSSを削除します。シリコーンシーラントのビーズプレキシグラス板に付着し、完全にウェッジと台座を囲むには、顕微鏡にPSS漏れを防ぐために効果的な予防策として、吸い出されていないすべてのPSSを収集する"堀"の役割を果たします。 切開は、陰嚢の腹側表面に沿って行われます。睾丸が腹腔内に精巣挙筋によって撤回されている場合は、下腹部で穏やかな圧力は、嚢に睾丸を指示します。睾丸を覆う精巣挙筋の表面は、この時点で識別する必要があります。陰嚢皮膚と精巣挙筋の間に結合組織は、慎重に周囲の組織から精巣挙筋を解放するために削除されます。 陰嚢皮膚を穏やかに台座の近位端の後ろに後退し、ピンとそれぞれの側に固定されています。精巣挙筋の表面の外面は、結合組織がクリアされます。解剖の水和物の結合組織中に連続灌流、可視性と除去を容易にする。 精巣挙筋の頂点を介してピンが縦張力の下に配置するために使用されます。縦切開は、血管供給の中断を最小限に抑えるために取ら細心の注意を払って筋肉の腹側表面を介して行われます。準備の周囲の近くに血流のダイナミクスは、この組織損傷14で変更されます。そのため、最小限に抑えるためにこれらは、イメージングおよび生理学的研究に使用されるデータの収集、準備の中心付近の血管に影響を与えます。 精巣挙筋は、睾丸の下にある精巣上体に薄い靭帯によって接続されている。片側に睾丸を反映して慎重に精巣上体から分離されているこの靭帯を、公開します。精巣挙筋の頂点付近で精巣上体に接続する小型の動脈と静脈です。鉗子とそれらを引くことが離れて出血を最小限に抑えるとの間でこれらの血管を閉塞する。睾丸、精巣上体、精巣動脈と静脈は、関連する鼠径脂肪パッドと一緒に（精巣摘出術）、（4-0または5から0絹縫合糸）近位に連結し、切断して破棄されます。また、睾丸を優しく腹腔内に押し戻さと綿またはキムワイプの一部を保持することができます。精巣摘出術は腹腔内に戻って睾丸を押すと組織することが可能外傷を避けるために提供しています。我々は手順7,15のいずれかを使用してクレマスター微小循環の準備の質の顕著な違いを（3.8節を参照）見つかっていない。 精巣挙筋の外部表面は、残りの結合組織がクリアしてから、台座の表面に放射状に広がっている。エッジはそのまま微小循環と横紋筋の平らなシートを作成するために5〜6箇所にピン（1.4項を参照）で固定されています。 完成した製剤は、連続的に灌流（3〜5 ml /分、34 ° C）と30分間平衡化、生体顕微鏡のステージに転送されます。 クレマスターの準備の整合性はいくつかの基準に従って評価されます。最小限の外科的外傷による自発的な血管運動神経性緊張は、細動脈と細静脈の接着白血球の不足で活発なフローで示されます。応答準備中の最も敏感なインデックスは、5〜10分間の灌流液の酸素含有量を高めるために細動脈の収縮です。この、21％O 2でそれを平衡化することによって行われます（対5％O 2、1.5節を参照して、すべて5％CO 2、バランスN 2）。細動脈における白血球の存在、毛細血管を流れる赤血球の有無、および/または白血球細静脈に蓄積し、周囲の組織は、組織の損傷や炎症の徴候です。 4。精巣挙筋の微小循環の生体内イメージング生体イメージングは​​、オリンパスMVX10ステレオズームプラットフォームに基づいてカスタム顕微鏡で実行されます。 MVX10顕微鏡本体明視野（ケーラー）イメージングのための透視（ハロゲンランプ）とし、蛍光イメージングのための落射照明（水銀灯）を装備したMVX10ハイブリッドスタンドにマウントされています。落射照明を使用して、GCaMP2は35分の520 nmで収集されたエミッションと30分の472 nmで励起される。パーソナルコンピュータ上でパイパーコントロールソフトウェア（SPI）を介して、XR/Mega-10激化、デジタルカメラ（SPIスタンフォードフォトニクス株式会社）を用いて、画像はMV PLAPO 2XCレンズ（オリンパス開口数= 0.50）を介して取得されます。このシステムでは、視野（FOV）の観測されたフィールドは、22ミリメートル× 18ミリメートル〜553μmからX 442ミクロンを変化させることができます。 生体内イメージング実験が完了すると、麻酔マウスは頚椎脱臼に続くペントバルビタールの過剰投与で安楽死されています。 5。代表的な結果マウス精巣挙の準備の生体内イメージングのための図1。マウスボード。 A）アルミプラットフォームとボディウェッジは（黄色のプラスチックで絶縁）底部から見た。プラットフォームの下面に固定された発熱抵抗体は熱伝導を提供しています。 B）加熱プラットフォームは、プラスチック製のくさびにかかっている。 C）身体のウェッジは、手術と生体顕微鏡のステージへの後続の転送用のプレキシガラスのボード上に配置されます。 Sylgard台座は赤い矢印で示されています。防水シリコーンのビーズは、顕微鏡に滴下からそれを防止する、生体内の手順の間に漏出する可能性のあるソリューションを含むように全体の準備を取り囲んでいる。 図2。広視野イメージングのためのカスタムMacroZoom顕微鏡。 ）XR/Mega-10 ICCDカメラ（スタンフォードフォトニクス）とMVX10顕微鏡本体（オリンパス）は、三眼鏡ポートに取り付け。顕微鏡本体のB）クローズアップビュー。 （A）ズームコントロール（0.63〜6.3X）、（b）のフィルタホイール、（c）の画像ダブラ（25倍光学倍率とNA = 0.50）。明視野（ケーラー）照明（コンデンサーNA = 0.55、作動距離= 27 mm）のC）サブステージのコンデンサー。 図3は、マウス精巣挙の準備を完了。暖かいビニール被覆アルミニウムプラットフォーム（黄色）上の仰臥位で麻酔マウス。体の位置は、テープで固定されています。精巣挙筋は、透明なシラスティックゴムの台座の上に放射状に広げ、端部に固定されます。灌流液は、プラスチック製のドリッパー（白矢印）を介して近位端に導入される。真空ライン（白矢印）は、キムワイプの芯を経由してソリューションを削除します。二つのマイクロピペットは、組織内のそれらの先端に位置し表示されます。参照電極（銀線）は、精巣挙筋の下端に固定されています。 図4。内皮にGCaMP2を表現する細動脈のネットワークを視覚化するための倍率の範囲を図示。 A））蛍光とB明視野像は、ビデオモニタ上で総合倍率= 42Xのために3.2倍の光学倍率で撮影。 [ビューのフィールド（FOV）= 4375 X 3470程度]。スケールバー= 500μmの。この倍率で作業する任意位置でのマイクロピペットの配置を容易にします。総合倍率のための6.4xはの光学倍率で撮影したC）蛍光およびD）明視野像= 83X（FOV = 2,200 × 1759μmの）。スケールバー= 200μmの。総合倍率については12.6Xの光学倍率で撮影したE）蛍光とF）明視野像= 165X（FOV = 1,100 X 885ミクロン）。スケールバー= 100μmの。 G）の画像ダブラ、光学倍率= 25.2Xと。スケールバー= 50μmの。