فيفو السابقين العدوى من الأنسجة الحية مع الفيروسات Oncolytic
Summary
Oncolytic الفيروسات واعدة لمداواة السرطان. القدرة على التأكد من عينات الأنسجة infectability يعيش الحصول عليها من المرضى قبل العلاج هو ميزة فريدة من نوعها لهذا النهج العلاجي. هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة الأنسجة ل<em> خارج الحي</em> العدوى بفيروس oncolytic النوعي والكمي الفيروسي لاحقة.
Abstract
Oncolytic الفيروسات (OVS) هي العلاجات التي تحاكي الرواية بشكل انتقائي في وتقتل الخلايا السرطانية 1. العديد من التجارب السريرية بتقييم فعالية مجموعة متنوعة من المنصات بما فيها oncolytic HSV ، الفيروسة الريوية وOVS الوقس لعلاج السرطان في الوقت الراهن 2-5 جارية. واحدة سمة رئيسية من الفيروسات oncolytic هو أن تكون معدلة وراثيا في التعبير عن الجينات المحورة المراسل الذي يجعل من الممكن تصور إصابة الأنسجة البيولوجية المجهري أو التلألؤ التصوير 6،7. هذه ميزة فريدة من نوعها نظرا لأنه من الممكن أن تصيب أنسجة الجسم الحي السابقين من المرضى قبل العلاج وذلك للتأكد من احتمال نجاح virotherapy oncolytic 8. ولهذه الغاية ، فمن الأهمية بمكان مناسب لعينة الأنسجة للتعويض عن عدم تجانس الأنسجة وتقييم الجدوى الأنسجة ، وبصفة خاصة للإصابة قبل 9. من المهم أيضا أن تتبع تكاثر الفيروس باستخدام الجينات المحورة إذا مراسل التي أعرب عنها منصة oncolytic فضلا عن المعايرة المباشرة للأنسجة التالية من أجل التجانس تميز بين العدوى فاشلة ومنتجة. الهدف من هذا البروتوكول هو لمعالجة هذه القضايا ، ويصف هذه الوثيقة 1. أخذ العينات وإعداد الأنسجة السرطانية للثقافة الخلية 2. تقييم جدوى استخدام أنسجة الأيضية صبغة زرقاء الامار 3. المجراة سابقا عدوى الأنسجة مثقف مع فيروس الوقس يعبر عن GFP أو يراعة luciferase 4. الكشف عن التعبير عن طريق التحوير أو مضان المجهري باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي (IVIS) 5. الكمي من الفيروس عن طريق فحص اللوحة. هذا الأسلوب شامل يقدم العديد من المزايا بما في ذلك سهولة تصنيع الأنسجة ، والتعويض عن عدم تجانس النسيج ، والسيطرة على بقاء الأنسجة ، والتمييز بين العدوى فاشلة والعظام تكاثر الفيروس النية.
Protocol
Discussion
واحدة من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هو الحصول على عينة الأنسجة الطازجة. وإذا وضعت العينة في الثقافة الخلية بعد انتظار طويل في غرفة العمليات في وسائل الاعلام غير ملائمة (مثل PBS) ، وهذا قد حل وسط بقاء الأنسجة ومنع infectability. من المذكرة ، الأنسجة الطبيعية هي بطبيعتها أكثر عرضة لهذه الآثار من الأنسجة السرطانية. نقطة أخرى الحاسم هو كيفية العديد من النوى المستخدمة لأخذ عينات من الأنسجة وتناسق حجمها. والتناقضات في الحجم تؤدي إلى تقلب عبر عينات من المرضى منذ عوامل مثل نقص الأكسجين والأنسجة السطحية infectectable سوف تتقلب تبعا لحجم النوى وأرباع الأساسية. في حين أن هذا يمكن أن تحل جزئيا باستخدام ماكينات تقطيع الأنسجة ، وميزة واحدة من الأسلوب المقدمة هنا هو أنه من السهل نسبيا ، وأقل عرضة للتلوث ، وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة ، بما في ذلك الأنسجة اللينة أو اللزجة التي لا تتقبل بسهولة لتشريح الأنسجة. خصوصا ، ويمكن زيادة عدد النوى من أجل الحصول على تمثيل أفضل الأنسجة. أيضا ، يمكن خفض النوى في أكثر من قطعة (على سبيل المثال 5-8) لاستيعاب المقايسات المحتملين الآخرين إلى أن يتم بالتوازي مثل الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، أو استخراج البروتين. ومع ذلك ، فإن عدد القطع التي يمكن من خلالها خفض أحجام العينات لاستنساخه تعتمد على الحجم الفعلي للالنوى ، والتي يمكن تعديلها باستخدام المثاقيب مختلفة الحجم. اختياريا ، طريقة واحدة للمساعدة في الحصول على قطعة نسيج الحجم بتكاثر هو حتى من طول النوى باستخدام مسطرة قبل اقتطاع مزيد منهم الى أجزاء اصغر. بطبيعة الحال يمكن للبروتوكول يمكن تعديلها لاستيعاب الفيروسات الأخرى وقد وجدنا أن الأنسجة يمكن أن تكون قابلة للبقاء ودعم النسخ المتماثل لمدة تصل إلى 6 أيام. كذلك يمكن للبروتوكول أن تمتد إلى قياسات الجينات المحورة فيروسي ، وأعرب الأخرى بما في ذلك cytrokines. بعد الإصابة ، ويمكن أيضا أن تكون جزءا لا يتجزأ من الأنسجة في البارافين لمزيد من sectioning وتلطيخ بالطرق المناعى ، مما يسمح للمزيد من الصقل من الأنسجة الأنسجة ومدى ارتباطه عدوى فيروسية 10-12.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور هشام Abdelbary لتوفير العينات الجراحية الإنسان عن البيانات الواردة في الشكل 2.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Amphothericin B solution | Sigma Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
| Pennicilin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Use at 1% |
| Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
| D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
| MEM powder | Gibco | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
| Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B7920 | |
| 2 mm Biopsy punch | Miltex | MX-33-31 | |
| Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
| Fluorescence disection Microscope | Leica | model M205 FA | |
| In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
| Tissue Tearor | Biospec products | model 985370-395 |
References
- Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer. Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).
- Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck. Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).
- Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. Reovirus: Rationale and clinical trial update. Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).
- Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 85-89 (2010).
- Boeuf, F. L. e. Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing. Mol Ther. 18, 888-895 (2010).
- Silva, N. D. e., Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).
- Diallo, J. S. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
- Cooke, S. L. Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer. Br J Cancer. , (2010).
- Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses. J Surg Res. , 1-6 (2010).
- Hochberg, M. Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers. Br J Dermatol. , (2010).
- Kuip, H. v. a. n. d. e. r. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).
