Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Na fusie met het sperma, de zygote ondergaat een reeks van dynamische gebeurtenissen. Deze gebeurtenissen transformeren de eicel van een relatief statische cel in de zich snel ontwikkelende embryo. In veel organismen, cytoplasmatische herschikkingen zijn van cruciaal belang voor het vaststellen van embryonale polariteit en eieren activering. De C. elegans embryo biedt een uitstekende gelegenheid voor het observeren van deze vroege gebeurtenissen van ei activering en embryogenese. Het embryo is transparant en de vroege ontwikkeling gebeurtenissen relatief snel na de bevruchting. C. elegans onderzoekers hebben gegenereerd veel nuttige transgene stammen die fluorescent gelabelde eiwitten die betrokken zijn uitdrukken in de vroege ontwikkeling. Met behulp van deze stammen, samen met RNAi of mutanten levert een krachtig systeem voor het ontleden van de moleculaire pathways dat de ontwikkeling van een meercellig organisme (5, 6, 7, 8) ten grondslag liggen. Deze video artikel presenteert een praktische benadering van het gebruik van deze instrumenten en technieken om gebeurtenissen vast te leggen gedurende de vroege embryogenese in C. elegans.

De volwassen C. elegans eicel wordt gearresteerd in profase van de meiose I en wordt bevrucht in de spermatheca van de volwassen hermafrodiet. Na de bevruchting de eicel opbrengst door de rest van meiose I en II. Deze stadia kan worden waargenomen met behulp van fluorescent gelabelde histon H2B (5). Tijdens de afronding van de moeder meiose, het sperma DNA blijft gecondenseerd (zie figuur 1). Na de voltooiing van meiose, de moederlijke en vaderlijke DNA wordt decondensed en de twee pronuclei formulier. De maternale pronucleus migreert naar de vaderlijke pronucleus en ze samen te voegen in het midden van het embryo. Mitose ontstaat snel na pronuclear vergadering. Al deze gebeurtenissen zich voordoen in minder dan een uur. Zo kan time-lapse microscopie van deze reeks van gebeurtenissen gemakkelijk worden bereikt. Het uitvoeren van deze techniek vereist bepaalde faciliteit in nematode kweken zowel als gewone microscopie vaardigheden in aanvulling op de toegang tot een confocale microscoop.

Het voorbeeld hier gepresenteerde maakt gebruik van een transgene C. elegans stam dat twee fluorescerende eiwitten, GFP uitdrukt:: ubiquitine-en mCherry:: H2B. Een confocale laser scanning microscoop wordt gebruikt om de dynamische lokalisatie van deze twee eiwitten te nemen. Daarnaast tonen we aan dat de injectie van fluorescent gelabelde Lysotracker kan worden gebruikt om het lot van lysosomen in het embryo na de bevruchting te volgen. Injectie van een label tracker kan ook worden uitgevoerd voor visualisatie van de mitochondriën of lokale calcium-concentraties (9). In theorie zou de injectie-protocol worden gebruikt om elke vorm van fluorescent gelabelde moleculen in de embryo. Dit kan het label kleine moleculen, eiwitten, vetten, enz. In sommige gevallen zijn, kan het niet nodig om daadwerkelijk te injecteren bestempeld trackers als de wormen zal gemakkelijk opname sommige kleurstoffen zoals mitotracker (10). Toch hebben we geprobeerd zowel de weken en injectie van lysotracker en hebben gevonden veel betere resultaten met injectie voor visualisatie in embryo's.

Technische overwegingen:

De technische uitdagingen die met deze procedure zijn de micro-injectie techniek en de moeilijkheid beeldvorming zeer vroege embryo's. Ten aanzien van micro-injecties, de dikte van de agarose injectie pad is van cruciaal belang voor een succesvolle injecties. Als het pad te dik is, zullen de wormen dessicate en sterven snel. Als het pad is te dun is, zullen de wormen niet aan de pad tijdens de injectie proces.

De vroege embryo's kunnen worden gevoelig zijn voor omgevingsfactoren, zoals temperatuur en buffer omstandigheden. Wild-type embryo's starten decondensation van het sperma DNA en pronuclear migratie binnen een minuut of zo van de voltooiing van meiose II (4). Binnen 20 minuten moet de eerste cytokinese te beginnen. Als embryo's worden blootgesteld aan zeer hoge intensiteit laser of oververhit of geplet tijdens de montage, kan dit proces worden verstoord. Dergelijke embryo's zullen arresteren ontwikkeling. Als dit gebeurt, moet het experiment worden herhaald met verminderd vermogen laser of een dikkere agarose pad.

C. elegans embryo's doen hun eierschaal niet scheiden tot kort na de bevruchting. Gedurende de korte tijd tussen de bevruchting en de afscheiding van de eierschaal, de embryo's niet levensvatbaar zijn buiten de moeder (11). Sommige laboratoria kunnen voorkomen deze uitdaging door de beeldvorming embryo's in utero (5, 12). In utero beeldvorming biedt bepaalde voordelen zoals de mogelijkheid om gebeurtenissen die zich voordoen tijdens of vlak na de bevruchting vast te leggen. Echter, deze techniek vereist het gebruik van een microscopie-systeem dat zorgt voor diep weefsel beeldvorming. Systemen zoals twee-foton of multi-foton zijn bijzonder geschikt voor deze (13, 14). Bij het gebruik van een conventionele laser-scanning of een draaiende schijf confocale microscoop, de beste beelden worden verkregen uit embryo's die hageweest uitgesneden van de volwassen worm zoals hier beschreven.

Imaging System overwegingen:

Het type van de confocale gebruikte beeldvormende systeem is afhankelijk van de behoeften van de gebruikers. In het algemeen worden laser scanning systemen aanbevolen als men wenst om beelden te verwerven met de hoogst mogelijke resolutie. Aan de andere kant, zijn draaiende schijf stelsels die beter voor de beeldvorming zeer dynamische processen als afbeelding overname is relatief snel en fotobleking / fototoxiciteit wordt verminderd.

De specifieke imaging parameters is afhankelijk van het experimentele ontwerp en de confocale werkzaam imaging systeem. In multidimensionale beeldvorming, dient men te overwegen het aantal kanalen, focale vliegtuigen, en de tijd-punten worden verzameld. Als gevolg van de beperkende effecten van fotobleken en fototoxiciteit, kan een eindig aantal beelden worden verworven in een bepaald experiment. Dus, als u ervoor kiest om het aantal kanalen te verwerven te verhogen, moet u waarschijnlijk het aantal van focale vliegtuigen en / of tijd punten en vice versa te verminderen. Het totaal aantal beelden dat kan worden verkregen zal worden beïnvloed door de intensiteit van het fluorofoor in beeld wordt gebracht, alsook de gevoeligheid van de confocale microscoop wordt gebruikt. Meer intense fluoroforen en meer gevoelige instrumenten vereisen kortere belichtingstijden en dus produceren minder fotobleken en fototoxiciteit.

Een groot aantal of imaging systemen zijn beschikbaar. We geven informatie over de systemen die zijn gebruikt in onze eigen laboratoria. Voor de beeldvorming worm embryo's door draaiende schijf confocale microscopie, gebruiken wij een Nikon TE2000U omgekeerde microscoop uitgerust met een 60X/1.4 NA Plan Apo doelstelling. De microscoop is aangesloten op een Yokogawa CSU10 draaiende schijf-eenheid, een Hamamatsu C9100-13 EM CCD-camera, en een Spectral Applied Research LMM5 laser-merge module met vier solid state lasers met een vermogen van 405, 491, 561 en 655 nm. Met behulp van dit systeem kunnen we vangen een of twee kanalen, zes tot twaalf focale vliegtuigen, 25 tot 50 tijdstippen (na 30 tot 60 seconden). Een typische blootstelling tijd is 100 tot 200 milliseconden.

Voor beeldvorming embryo's met laser scanning confocale microscopie, gebruiken we een Zeiss LSM700 uitgerust met 2 kanalen en vier solid state lasers (405, 488, 555 en 635 nm). Dit systeem is gekoppeld aan een Zeiss Axio Observer omgekeerde microscoop met een Plan-Apo 63X/1.4NA doel gebruikt worden voor embryo beeldvorming. Het systeem maakt gebruik van de Zeiss ZEN software voor het imago van acquisitie, die ook voorziet in beperkte beeldverwerking en analyse. Wanneer beeldvorming met twee fluorochromen, typisch we 1-5 focale vlakken (~ 0.5 micrometer van elkaar) te verzamelen en het verzamelen van een Z-stack om de 15 seconden. Collecties worden voortgezet tot een significante fotobleken heeft plaatsgevonden. Voor het genereren van de laatste time-lapse video, zijn Z stapel foto's worden geconsolideerd volgens de maximale projectie tool in de ZEN software. Video's worden geëxporteerd vanuit de software als avi-bestanden.