Summary

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Published: July 01, 2011
doi:

Summary

تعرض هذه الورقة على تدفق الخلوي على أساس أسلوب التحقيق في تكوين المناعة في aortas. ورقة يوضح أيضا تقنية إضافية تسمح بدراسة البرانية المحيطة وجدار الوعاء الدموي بشكل منفصل. هذه الطريقة يفتح الاحتمالات لإجراء تحليلات phenotypical من الكريات البيض الأبهر وتطبيق المقايسات المناعية للدراسات عدة تصلب الشرايين.

Abstract

تصلب الشرايين هو عملية التهابات مزمنة من السفن المتوسطة الحجم والكبيرة التي يتميز تشكيل لويحات التي تتكون من خلايا رغوية ، وخلايا المناعة وخلايا العضلات الوعائية البطانية وسلس ، والصفائح الدموية ، المصفوفة خارج الخلية ، والدهون الأساسية الغنية مع واسعة النطاق ونخر تليف الأنسجة المحيطة بها ، ويشارك الأسلحة (1) الفطرية والتكيفية للاستجابة مناعية في التنمية ، وبدء واستمرار تصلب الشرايين. 2 و 3 وهناك مجموعة كبيرة من الأدلة على أن مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية الكبيرة ، شجيري الخلايا اللمفية تي ، وباء ، موجودة داخل aortas من الفئران صحية وتصلب الشرايين المعرضة – 4. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على خلايا المناعة في البرانية الأبهر المحيطة الأمر الذي يوحي بدور هام في هذا النسيج من تصلب الشرايين. 2

لبعض الوقت ، كانت محدودة للكشف كمية من أنواع مختلفة من الخلايا المناعية ، وضعهم التنشيط والتكوين الخلوي داخل جدار الشريان الأبهر بواسطة RT – PCR وطرق المناعى لدراسة تصلب الشرايين. بذلت محاولات قليلة لتنفيذ التدفق الخلوي باستخدام aortas الإنسان ، وعدد من المشاكل ، مثل ارتفاع تألق ذاتي ، تم الإبلاغ عن 5،6. وهضم لويحات تصلب الشرايين مع الإنسان كولاجيناز 1 ، وجمعت الخلايا الحرة والملون لCD14 + / + CD11c لتسليط الضوء على الخلايا المشتقة من البلاعم الرغوة. في هذه الدراسة ، تم استخدام "وهمية" قناة لتجنب تلطيخ إيجابية كاذبة. 6 مواد نخرية المتراكمة أثناء عملية الهضم تؤدي إلى توافر كميات كبيرة من الحطام الذي يولد تألق ذاتي عالية في عينات الأبهر. لحل هذه المشكلة ، وقد اقترحت لجنة المراقبة السلبية والإيجابية ، ولكن يمكن تطبيقها فقط تلطيخ مزدوجة في هذه العينات. قمنا بتطوير التدفق الخلوي الجديد القائم على أسلوب 7 لتحليل تركيبة الخلايا المناعية وتميز التنشيط ، والانتشار ، والتمايز للخلايا المناعية في الشريان الأورطي صحية وتصلب الشرايين المعرضة لل. هذا الأسلوب يسمح للتحقيق في تكوين الخلايا المناعية للجدار الشريان الأبهر ويفتح احتمالات لاستخدام مجموعة واسعة من الطرق المناعية للتحقيقات جوانب المناعة من هذا المرض.

Protocol

1. عزلة aortas الفئران مطلوب موافقة اللجنة المؤسسية IACUC الإجراء للعمل مع الفئران. إعداد برنامج تلفزيوني heparinzed بإضافة 1000 وحدة هيبارين الصوديوم إلى PBS 50 ملم وقلب الأنبوب إلى المزيج. يعد …

Discussion

هنا ، نقدم طريقة التدفق الخلوي قائم على التحقيق في تكوين الخلايا المناعية من aortas الفئران. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو القدرة على تحليل الخلايا المناعية الأبهر عند مستوى خلية واحدة ، وتميز الوضع تنشيط الكريات البيض الأبهر. لا يقتصر هذا الأسلوب لaortas الفئران ، ونحن…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح : PO1 HL55798 (لكوالا لمبور) وجمعية القلب الأميركية للتنمية منح العلماء 0525532U (لمصر).

Materials

Material Catalog Number Company
Collagenase XI C7657 Sigma-Aldrich
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
DNase I, type 2 D4527 Sigma-Aldrich
Collagenase I C0130 Sigma-Aldrich
Collagenase II LS004174 Worthington Biochemical Corporation
Elastase LS002292 Worthington Biochemical Corporation

References

  1. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
  2. Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
  3. Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
  4. Galkina, E., Ley, K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).
  5. Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. 39, 158-165 (2000).
  6. Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a “mock” FL3 channel in flow cytometry. Cytometry. 29, 155-164 (1997).
  7. Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).
  8. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
  9. Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 121, 1746-1755 (2010).
  10. Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells. Circulation. 119, 1424-1432 (2009).

Play Video

Citer Cet Article
Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848, doi:10.3791/2848 (2011).

View Video