Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi

1. Ortam hazırlanması Toz (1.01614.1000-EMD,% 0.6 Arıtılmış Agar çözüm – DMEM/F-12 (1X), Sıvı 01:01 (Invitrogen 10.565-042) – medya% 10 FBS (Gibco 16.140-071) kullanılarak hazırlanmıştır. .) Deney boyunca steril koşullar tutuldu. FBS medya 5ml hazırlanması için (16.140-071 – Gibco) – 50ml son hacim Sıvı 1:1 (Invitrogen 10.565-042), DMEM/F-12 (1X) 45mL eklendi. Hazırlanan medya, 37 ° C sıcaklık su banyosunda tutuldu. Agar çözüm ısı mikrodalga yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır. 0.3 gram toz agar mikrodalga kullanarak 50ml distile su dağıldı. Agar çözüm su banyosu içine tutarak 37 ° C sıcaklığa kadar soğumaya oldu. Biz medya adım 1.2 ve 1.3 ve hazır stok çözelti eşit hacimde kullandı. Oranı% 0.6 agar (0.5mL) ve% 10 FBS-D-MEM/F-12 medya (0.5mL), 1:1, 6 kuyucuğu her kuyuda toplam hacim 1 ml. 2. Doku işleme Glioblastoma Multiforme (GBM) dokuları Patoloji Anabilim Dalı ameliyattan sonra hemen alındı. Doku Patoloji Anabilim Dalı GBM olarak sınıflandırıldı. Doku dikkatlice forseps kullanarak patri plakalı aktarılır ve buz 5ml 1XPBS ile 3 kez yıkandı. Disseke örneklerinden bir cerrahi bıçak (Feather-2976 # 10) ve forsepsle (balıkçı bilimsel) ile tümör bloklar (çapı yaklaşık 10 mm) oluşturmak için numuneler seri bölümleri kesilmiştir. Blokları 6 plaka aktarılır. Her ortam de içeren oldu 1mL 1.4 adım söz. Doku doku canlı tutmak için hava yeterince maruz vardı. Tümör bloklar sonra DMSO (% 5) veya TMZ (2.5 nM) enjekte edilir ve 37 ° 16 saat süreyle inkübe edildi ° C,% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş hava. DMSO 0.1ml (% 5) veya TMZ tutarlı tedavisi için farklı yerlerde tümör bloklar 3 kez enjekte edildi. 28G1 / 2 0.37X12.7mm İnsülin Şırınga 1mL (Rahatlık noktası 26.027) kullanarak ilaç enjekte edildi. 16 saat sonra blok 3 kez 5 ml 1XPBS ile yıkandı. Bloklar yıkadıktan sonra 10 ml, 50 ml tüpler 24 saat için v / v% 10 formalin (Ricca kimya şirketi) (BASIX 5.539.802) ile tespit edildi ve 4μm bölümleri gömülü parafin için işlenmiş. "HAYIR ISI" formalin sabit bölümünde heyecan plaka beher yerleştirilir ve 30 dakika her çözüm için aşağıdaki çözümleri yoluyla işlenmiş. % 30 etanol,% 50 etanol,% 75 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol, ksilen. Doku kağıt havlu, lekelenen ve 30 dakika boyunca erimiş parafin (58 – 60 ° C, Fisher paraplast parafin) yerleştirildi. Doku Surgipath Blue Ribbon parafin kullanarak kalıpları gömülü, gömülü doku oda sıcaklığına kadar soğutulur. Parafin 4μm doku kesitlerinde alınan ve Fisher Plus, slaytlar yerleştirildi. 3. İmmünohistokimya Daha önce açıklandığı gibi İmmünohistokimya yapıldı. 1 Deparaffinization ve rehidrasyon rafa yerleştirin slaytlar ve aşağıdaki adımları uygulayın. 3×5 dakika (5 dakika boyunca 3 kez), 3×5 dakika süreyle% 100 etanol, 1×5 dakika boyunca% 95 etanol, 1×5 dakika boyunca% 70 etanol, ksilen, 3 dakika boyunca çalışan musluk suyu ile durulayın. Bir cam behere distile su ile seyreltilmiş 1X sitrat tamponu (Thermo bilimsel-AP9003-500), ısıya bağlı epitopu alma daldırın slaytlar ile antigen retrieval. Sıcak bir tabak (emin bölümleri don "t slayt düşmek olun) 15 dakika boyunca kaynatın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle soğuk çözüm. Slaytlar 3×5 dakika için 1X PBS ile yıkayın. Iç peroksit inhibisyonu, 15 dakika boyunca cam beher% 0,3 hidrojen peroksit (distile su Fisher Scientific-BP2633-500-seyreltilmiş), metanol slaytları (Fisher Scientific-A-452-4) bırakın. 3×5 dakika için 1X PBS içinde durulayın. % 10 normal keçi serumu ile dokuların Kapak engelleme. Nemli bir kutuya aktarın ve slaytlar az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Slaytlar, 3×5 dakika için 1X PBS ile yıkayın. 1X PBS ile sulandırılmış insan özel Kaspaz-3 (1:1,000, Ar-Ge sistemleri, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15.626): Primer antikor Bölüm ° C primer antikor ile aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 gece inkübe edildi. Ertesi gün 1X PBS 3×10 dakikalık slayt durulayın. İkincil antikor reaksiyonu dokuların HRP etiketli ikincil antikor 2-3 damla (tahayyül sistemleri) ile kaplayın. Slaytlar nemli bir kutuya koyun ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 3×10 dakika için 1X PBS ile yıkayın. Algılama üreticinin protokolü takiben primer antikor tespiti için kromojen DAB kiti (Vektör laboratuarlar-SK-4100) geliştirin. Sayaç boyama (hematoksilen ile slaytlar daldırın 10-15 s saniye basılı tutun) emin don "t taşması DAB sinyali olun. 3 dakika şebeke musluk suyu ile durulayın. Dehidrasyon daldırın aşağıdaki sırayla slaytlar, Ksilen 3×5 dakika için 5 dakika, 5 dakika boyunca% 95 etanol, 3×5 dakika süreyle% 100 etanol,% 70 etanol. Kapak permount montaj reaktifi (Fisher Scientific-SP-15-100) ile slaytlar kayma. Görüntüler Olympus floresan mikroskobu (DP-72) .3.11) kullanarak alınmıştır. Tüm deneyler, özel etiketleme primer antikor olmadan negatif kontrol tarafından da teyit edildi. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Glioblastoma multiforme (GBM) cerrahi örneği toplandı. Temozolomide (TMZ) dahil olmak üzere önceden kemoterapi olmadan hastalarda ilk cerrahi uygulandı. Şekil-1a Gadolinyum geliştirme ile MRI T1 ağırlıklı görüntü, ameliyattan önce sağ frontal lob gelişmiş bir tümör saptandı. Ameliyat sonrası görüntü (Şekil-1b), cerrahi sonrası lezyonun subtotal çıkarılması doğruladı. Cerrahi dokuların klinik tanı amaçlı Patoloji Anabilim gönderildi ve kalan örnekleri onaylanan Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK), Ohio State Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından da protokol kapsamında doku ihale işlendi. Hematoksilen ve Eosin (H & E) ile boyanarak nekroz varlığı pseudopallisading hücreleri, ve mikrovasküler proliferasyon (Şekil 1-c) gösterdi. Böylece, bu tümörlerin histopatolojik GBM olarak teşhis edildi. Notu, 48 saate kadar TMZ olmadan inkübasyon tümör eksplantlar GBM hücre mimarisini korumuştur. Aksine, 72 saat veya daha uzun kuluçka, bazı tümör hücreleri başlayan düşündüren örneklerinde yoğunlaşmış çekirdeklerin artan sayıda fark apoptozis tabi. Sonuç olarak, uzun inkübasyon sonrası tümör dokularında tümör hücrelerinin, tercihen nekrotik alanlar (veriler gösterilmemiştir) ve çevresinde gözlenmiştir kaybetti yamalı bölgeleri içeriyordu. Bu tümör eksplant örnekleri güvenilir ilaç etkinliğini test amaçlı kullanılabilir araştırmak amacıyla, TMZ tedavi etkisi test edilmiştir. Şekil-2 Bu çalışmada deneyler akışını temsil eder. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, TMZ intratümöral enjeksiyon, bu ilacın 2 sistemik yönetiminin daha malign glioma büyüme kontrolü daha güçlü etkiye sahip olduğunu belirtti. 16 saat inkübasyon sonrasında, bu eksplantlar parafin ve seri bölümleri boyama için hazırlanmıştır gömüldü. TMZ tedavi GBM dokuların İmmünohistokimya kontrol örnekleri ile karşılaştırılması Ki-67 pozitif tümör hücrelerinin önemli bir azalma göstermiştir. Buna karşılık, bir apoptozis marker, Kaspaz-3, ile immünohistokimya TMZ tedavi glioma numuneler ve kontrol numuneleri (Şekil-3) arasında anlamlı bir fark elde edemedim. TMZ ile tedavi etkisi daha fazla in vitro kültür veya flow sitometri ile birlikte bu eksplant tahlil birleştirerek karakterize edildi. Özellikle, kök hücre gibi tümör hücrelerinin (SCLTC) üzerindeki etkisini belirlemek için çalıştı. Bu nedenle, TMZ ile intratümöral tedaviyi takiben, küre oluşturan bu tümör eksplant tahlil ve flow sitometri yapıldı. TMZ muamele örnekleri tek tek tek hücrelerin içine ayrışmış ve bu tek hücre, serum serbest ortamda bFGF ve AGF ile desteklenen 96-kuyucuğu (1 mikrolitrelik hücre başına veya daha düşük) bir düşük yoğunluklu ekilirler. Kontrol grubunda ise 7 günlük inkübasyondan sonra, tümör eksplantlar tümör alanlarında oluşumu gözlenmiştir. Kürenin oluşumu SCLTC 3 4 bir özellik olduğu göz önüne alındığında, bir ilaç tedavisi ile tümör küre sayısında değişiklikler SCLTC üzerindeki etkisini gösterir. Benzer şekilde, bir hücre yüzey marker, CD133 ile ayrışmış tümör eksplant flow sitometri, SCLTC üzerindeki etkisini doğrulamak amacıyla yapılmıştır. GBM heterojen tümör hücrelerinde SCLTC seçici bir ilaç tedavisi ile ortadan kaldırılması ise, bir tedavi (veriler gösterilmemiştir) flow sitometri CD133 pozitif kesir azalma tespit tahmin olabilir. Bir hasta GBM Şekil.1 Manyetik rezonans görüntüleri (MRG), operasyon öncesi Şekil-1a ve post-işlem Şekil-1b Temsilcisi rakamlar . Şekil-1c, taze GBM doku örneği H & E boyama. Orijinal büyütme, 40X. Şekil. 2 blok kültür deney deneysel akışı Şekil-2a. Image taze cerrahi GBM patoloji bölümü alınan. Şekil-2b yardım cerrahi bıçak ile 10mm küçük parçalar halinde Diseksiyon tümör bloğu gösterir. Şekil-2c insülin şırınga kullanarak tümör blokları (TMZ) ilaç tedavi yöntemidir. e 3 "/> Şekil. 3 İmmünohistokimya aktif Kaspaz-3 ve Ki67 DMSO veya TMZ enjekte GBM doku blokları İmmünohistokimya. Hematoksilen nükleer boyanma için kullanılmıştır. Orijinal büyütme, 40X.