שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי

1. הכנה של התקשורת התקשורת הוכן באמצעות 10% FBS (16140-071 – GIBCO) ב DMEM/F-12 (1X), נוזלי 01:01 (10565-042 – Invitrogen) עם פתרון אגר 0.6% מטוהרים, מגורען (1.01614.1000-EMD ). בתנאים סטריליים נשמרו לאורך כל הניסוי. להכנת 5 מ"ל התקשורת של FBS (16140-071 – GIBCO) נוספה 45mL של DMEM/F-12 (1X), נוזלי 01:01 (10565-042 – Invitrogen) שהופך נפח סופי של 50 מ"ל. התקשורת מוכנה הוחזק אמבט מים בטמפרטורה 37 ° C. הפתרון אגר הוכן באמצעות שיטת במיקרוגל החום. 0.3 גרם אגר היה מגורען מומס במים מזוקקים 50 מ"ל באמצעות מיקרוגל. הפתרון אגר היה מגניב עד 37 ° C טמפרטורה ידי שמירה על אותה לאמבטיה מים. השתמשנו נפח שווה של מדיה מן צעד 1.2 ו – 1.3 פתרון מלאי מוכן. יחס אגר 0.6% (0.5mL) ו -10% FBS-D-MEM/F-12 מדיה (0.5mL) היה 01:01, מה שהופך את הנפח הכולל של 1 מ"ל היטב כל אחד 6 צלחות היטב. 2. עיבוד רקמות Glioblastoma multiforme (GBM) ברקמות התקבלו מיד לאחר הניתוח מן המחלקה לפתולוגיה. הרקמה סווגה GBM מן המחלקה לפתולוגיה. רקמה הועבר צלחת patri באמצעות מלקחיים ובזהירות ורחץ עם קרים כקרח 1XPBS 5 מ"ל במשך 3 פעמים. סעיפים סידורי הדגימות נחתכו מן דגימות גזור ליצור בלוקים הגידול (בקירוב 10 מ"מ קוטר) עם להב כירורגי (Feather-2976 # 10) המלקחיים (פישר סיינטיפיק). בלוקים הועברו לתוך צלחת 6 באר. כל 1mL גם היה המכיל התקשורת להזכיר בשלב 1.4. הרקמה היתה חשיפה מספיק אוויר כדי לשמור על רקמת קיימא. בלוקים גידול הוזרקו אז גם עם DMSO (5%) או TMZ (2.5 ננומטר) מודגרות עבור 16 שעות 37 מעלות צלזיוס באוויר humidified CO2 המכיל 5%. 0.1mL של DMSO (5%) או TMZ היה מוזרק 3 פעמים גושי גידולים במקומות שונים לטיפול עקבי. התרופה היה מוזרק באמצעות מזרק אינסולין 1mL 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (נוחות נקודה 26,027). לאחר 16 שעות בלוקים נשטפו עם 5 1XPBS מ"ל במשך 3 פעמים. אחרי כביסה אבני תוקנו עם 10 מ"ל של 10% v / v פורמלין למשך 24 שעות (החברה Ricca כימי) בתוך 50 מ"ל צינורות (Basix-5539802) ומעובד פרפין מוטבע 4μm חלקים. סעיף קבוע פורמלין הונחה כוס בצלחת ומערבבים עם "חימום" ומעובד באמצעות הפתרונות הבאים במשך 30 דקות כל פתרון. אתנול 30%, אתנול 50%, אתנול 75%, אתנול 80%, אתנול 95%, 100% אתנול, ו – קסילן. הרקמה נמחק על מגבות נייר והושמו פרפין נמס (58 עד 60 ° צלזיוס, פרפין פישר Paraplast) במשך 30 דקות. הרקמה היה מוטבע באמצעות תבניות Surgipath פרפין Blue Ribbon, רקמה מוטבע קוררו לטמפרטורת החדר. מוטבע פרפין סעיפים 4μm רקמות שנלקחו והניח בשקופיות פישר פלוס. 3. אימונוהיסטוכימיה אימונוהיסטוכימיה בוצע כפי שתואר לעיל. 1 Deparaffinization ומקום התייבשות השקופיות במעמד ולבצע את השלבים הבאים. קסילן עבור 3×5 דקות (3 פעמים במשך 5 דקות), 100% אתנול דקות 3×5, אתנול 95% במשך דקות 1×5, אתנול 70% עבור 1×5 דקות, לשטוף במים זורמים ברז במשך 3 דקות. Antigen אחזור עם חום הנגרמת epitope שקופיות אחזור לטבול חיץ ציטראט 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) מדולל במים מזוקקים בכוס זכוכית. מרתיחים במשך 15 דקות על פלטה חשמלית (לוודא סעיפים דון "לא ליפול השקופית). פתרון מגניב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם 1X PBS עבור 3×5 דקות. עיכוב של מי חמצן פנימי לטבול את השקופיות של מתנול (פישר סיינטיפיק-A-452-4) עם מי חמצן 0.3% (פישר סיינטיפיק-BP2633-500-מדולל במים מזוקקים) בכוס זכוכית למשך 15 דקות. יש לשטוף ב 1X PBS עבור 3×5 דקות. חסימת כיסוי הרקמות עם סרום 10% עז נורמלי. העברת שקופיות בתוך קופסה לח דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם 1X PBS עבור 3×5 דקות. מדורים נוגדן ראשוני הודגרו לילה ° C עם נוגדן ראשוני בריכוזים הבאה 4: caspase-3 אנושי ספציפי (1:1,000, R & D מערכות, AF835), Ki67 (01:01, Dako, 15626) מדולל 1X PBS. שטפו את השקופיות 1X דקות PBS 3×10 ביום המחרת. תגובת נוגדנים משני מכסים את רקמות עם 2-3 טיפות של נוגדן הנקרא HRP משנית (לדמיין מערכות). שים שקופיות בתוך קופסה לח דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 1X PBS עבור 3×10 דקות. איתור לפתח עבור DAB אב צבע ערכה (וקטור מעבדות-SK-4100) לאיתור נוגדן ראשוני הבאים פרוטוקול של היצרן. מכתים מונה לטבול את השקופיות עם hematoxylin (15/10 s econds, ודא דון "לא מוצף DAB אות). לשטוף עם מים זורמים ברז במשך 3 דקות. לטבול התייבשות השקופיות כדי שלאחר מכן, אתנול 70% במשך 5 דקות, אתנול 95% במשך 5 דקות, 100% אתנול דקות 3×5, קסילן עבור 3×5 דקות. כיסוי להחליק את השקופיות עם מגיב הרכבה permount (פישר סיינטיפיק-SP-15-100). תמונות שנלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אולימפוס (DP-72) .3.11). בניסויים כל, תיוג ספציפית אושרה על ידי שליטה שלילי ללא נוגדן ראשוני. 4. נציג תוצאות: אספנו דגימות כירורגית של multiforme glioblastoma (GBM). החולים שעברו את הניתוח הראשון ללא chemotherapies לפני כולל temozolomide (TMZ). התמונה T1-המשוקלל של בדיקת MRI עם גדוליניום שיפור באיור-1a הראו גידול משופרת באונה המצחית הימנית לפני הניתוח. התמונה לאחר הניתוח (איור-1b) אישר סכום ביניים של הסרת הנגע לאחר הניתוח. רקמות כירורגית נשלחו המחלקה לפתולוגיה לצורך אבחון קליני, ואת דגימות הנותרים עובדו על רכש את הרקמה תחת עמוד אישרה סקירה מוסדיים (IRB) פרוטוקול בבית של אוניברסיטת מדינת אוהיו המרכז הרפואי. Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים הפגינו נוכחות של נמק, תאים pseudopallisading, ועל כלי הדם התפשטות (איור 1-c). לכן, גידולים אלה אובחנו histopathologically כמו GBM. ראוי לציין, explants הגידול הבאים הדגירה ללא TMZ עד 48 שעות שמרו על cytoarchitecture של GBM. לעומת זאת, עם הדגירה של 72 שעות או יותר, שמנו לב מספר גדל של גרעינים מרוכז בדגימות, דבר המצביע על כמה תאים סרטניים מתחילים עוברים אפופטוזיס. כתוצאה מכך, רקמת הגידול הבאים הדגירה כבר הכילה אזורים בלתי סדיר כי איבד תאים סרטניים, אשר נצפו ליד מעדיפים סביב אזורים נמקי (מידע לא מוצג). על מנת לחקור אם אלה דגימות explant הגידול יכול להיות מנוצל באופן מהימן לצורך בדיקת יעילות התרופה, בדקנו את ההשפעה של טיפול TMZ. תרשים 2 מייצג את הזרימה של הניסויים במחקר זה. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי הזרקה intratumoral של TMZ יש השפעה חזקה יותר על בקרת הצמיחה של glioma ממאיר מזו של ממשל מערכתית של תרופה זו 2. לאחר דגירה של 16 שעות, explants אלה היו מוטבעים עם פרפין וחתכים סדרתי מוכנים מכתים. אימונוהיסטוכימיה של TMZ שטופלו רקמות GBM הפגינו צמצום משמעותי של Ki-67 חיובי תאים סרטניים בהשוואה דגימות שליטה. בתורו, אימונוהיסטוכימיה עם סמן אפופטוזיס, caspase-3, לא הניב שום הבדל משמעותי בין TMZ שטופלו דגימות glioma לבין דגימות הביקורת (איור 3). השפעת טיפול עם TMZ התאפיינה יותר על ידי שילוב זה יחד עם assay explant או בתרבות חוץ גופית או cytometry הזרימה. באופן ספציפי, אנחנו ביקשו לקבוע את ההשפעה על תאים כמו בתאי גזע סרטניים (SCLTC). לכן, לאחר הטיפול intratumoral עם TMZ, הופענו assay כדור להרכיב cytometry זרימה של אלה explants הגידול. TMZ שטופלו דגימות היו ניתק לתוך תאים בודדים בודדים אלה תאים בודדים היו זורעים בצפיפות נמוכה (1 תאים לכל microliter או התחתון) של צלחות 96-היטב במדיום סרום ללא בתוספת bFGF ו EGF. בקבוצת הביקורת, היווצרות הגידול בתחומים מן explants הגידול נצפתה לאחר דגירה 7 יום. בהתחשב בכך היווצרות כדור הוא מאפיין של SCLTC 3 4, שינויים במספר תחומים הגידול על ידי טיפול בתרופה מעיד על השפעה על SCLTC. באופן דומה, cytometry זרימה של explants הגידול ניתק עם סמן תא השטח, CD133, בוצע כדי לוודא את ההשפעה על SCLTC. אם SCLTC בתאי גידול הטרוגניות GBM הושרשו סלקטיבי על ידי טיפול תרופתי, ניתן לנבא כי cytometry זרימה אמור לזהות ירידה של שבריר CD133 חיובי על ידי טיפול (מידע לא מוצג). Figure.1 תמונות תהודה מגנטית (MRI) של GBM חולה. דמויות נציג מבצע טרום איור-1a שלאחר הניתוח איור-1b. איור-1c הוא H & E מכתים המדגם GBM טרי רקמות. ההגדלה המקורי, 40X. איור. 2 זרם ניסיוני של הניסוי תרבות לחסום. באיור-2a. תמונה של GBM כירורגית טרי שהתקבלו המחלקה לפתולוגיה. איור מראה Dissection-2b של גוש הגידול לחתיכות קטנות 10mm בלהב כירורגי לעזור. איור-2c היא (TMZ) תרופה לטיפול בלוקים הגידול באמצעות מזרק אינסולין. ה 3 "/> איור. 3 אימונוהיסטוכימיה. אימונוהיסטוכימיה של גושי רקמה GBM הזריקו DMSO או TMZ עם הפעלת caspase-3 ו Ki67. Hematoxylin שימש מכתים גרעיני. ההגדלה המקורי, 40X.