성인 Zebrafish의 신장의 해부

1. 고정되지 않은 동물의 샘플에서 성인 zebrafish의 신장의 해부 해부에 대한 시대에 3-6개월 사이의 성인 zebrafish를 선택합니다. 아가미가 이동하고 심장 박동 중지 중지 있는지주의 깊게 관찰, 약 4~5분에 대한 0.2 % Tricaine 산도 7.0 그릇에 그것을 배치하여 물고기를 안락사. 스푼을 사용하여, 솔루션의 소량의 Tricaine 욕조에서 물고기를 리프트 솔루션을 가만히 따르다 부드럽게 종이 타월에 동물을 놓으십시오. 그냥 길 operculum (그림 1, 경로) 뒤에 상처를 만들고, 동물의 머리를 제거하는 해부 가위의 날카로운 쌍을 사용합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 머리를 삭제. 머리부터 꼬리 지느러미와 (그림 1, 경로 B)의 기본에 꼬리를 종료, 긴 복부 절개를하여, 동물의 시체를 엽니다 해부 가위를 사용합니다. 해부의 핀셋 / 포셉 한 켤레를 사용하여 동물의 내장을 제거하고, 생물 학적 폐기물에서 그들을 놓으십시오. 이것은 신장의 위치 (그림 2)와 같이, 등의 신체 벽 브러시하지 않도록주의하십시오. 당신이 여성 물고기를 선택한 경우, 당신은 가장 쉽게 집게 또는 핀셋의 직각 쌍을 사용 할 수 뱃속의 개발 달걀을 푸다해야합니다. 절개 트레이에 몸을 벽을 열고 핀, 그리고 신장이 시각 수 있도록 핀을 각도 절개의 바늘을 사용합니다. 신장은 특징적인 모양 (머리, 트렁크 / 안장, 꼬리)와 색상을 가지게 되리라 블랙 hued 착색 (그림 2)와 interspersed되고. 당신은 또한 장기 구조의 정중선을 실행 말초혈, 가득 대동맥를 볼 수 있습니다. 당신이 그것을 기초 결합 조직에서 오르간을 별도로 신장을 리프트로 포셉 중 한 쌍을 사용 등의 신체 벽에서 신장을 분리하기 위해 미세 집게를 사용하십시오. 부드럽게 같은 외과 준비에 대한 1X PBS를 포함하는 microcentrifuge 관으로 더 라이브 세포 연구에 대한 원하는 차량에 신장을 놓으십시오. 2. 고정 동물의 샘플에서 성인 zebrafish의 신장의 준비 및 해부 4퍼센트 paraformaldehyde/1X의 PBST의 솔루션을 준비합니다. 솔루션에 PFA를 해산하기 위해 솔루션을 삶아 다음 ° C 4 혼합물을 냉각하고 0.1 % dimethylsulfoxide를 추가합니다. 우리는 냉동 aliquots 반대로 갓 만든 PFA 솔루션을 사용하여 조직 보존과 함께 가장 성공을 있었다. 잠수함 해부 동안 성인 zebrafish를 충분히 솔루션을 확인하십시오. 잠수함 해부 동안 성인 zebrafish를 충분히 고정 솔루션으로 절개 트레이를 채우십시오. 우리는 고정 냄새에 노출을 최소화하기 위해 화학 후드에 놓일 수있는 현미경이 위치 트레이와 후속 단계를 수행합니다. 해부에 대한 시대에 3-6개월 사이의 성인 zebrafish를 선택합니다. 보고 신중하게 지켜보고, 약 5 분 동안 0.2 % Tricaine 산도 7.0 그릇에 그것을 배치하여 물고기를 안락사되는 아가미와 심장 박동 정지. 스푼을 사용하여, 솔루션의 소량의 Tricaine 욕조에서 물고기를 리프트 솔루션을 가만히 따르다 부드럽게 종이 타월에 동물을 놓으십시오. 그냥 길 operculum (그림 1, 경로) 뒤에 상처를 만들고, 동물의 머리를 제거하는 해부 가위의 날카로운 쌍을 사용합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 머리를 삭제하고, 즉시 PFA 함유 절개 트레이에 동물을 놓으십시오. 머리부터와 꼬리 지느러미 (그림 1, 경로 B)의 기본에 꼬리를 종료, 긴 복부 절개를하여, 동물의 시체를 엽니다 해부 가위를 사용하여 부분적으로 동안 잠수 신체를 유지 절차. 해부의 핀셋 / 포셉 한 켤레를 사용하여 동물의 내장을 제거하고, 생물 학적 폐기물에서 그들을 놓으십시오. 이것은 신장의 위치 (그림 2)와 같이, 등의 신체 벽 브러시하지 않도록주의하십시오. 신체 벽면을 열고 핀, 그리고 신장이 시각 수 있도록 핀을 각도 절개의 바늘을 사용합니다. 신장은 검은색 hued 착색 (그림 2)와 interspersed되는 특성 모양 (머리, 안장, 꼬리)와 색상을 가지고 있습니다. 당신은 또한 장기 구조의 정중선을 실행 말초혈, 가득 대동맥를 볼 수 있습니다. 4 트레이를 배치, 야간 샘플을 수정 ° 당신이 원하는 샘플을 꺼리 완료되면 C. 다음날, 트레이에서 PFA 솔루션을 제거하고 1X PBST로 바꿉니다. 주의깊게 당신이 그것을 기초 결합 조직에서 오르간을 별도로 신장을 리프트로 포셉 중 한 쌍을 사용 등의 신체 벽에서 신장을 분리하기 위해 미세 집게를 사용하십시오. 신장 조직은 가능한 한 조각의 전체 신장 장기를 해부하다 수 있도록, 정착액 솔루션 DMSO에서 부드러운 고분 고 분한 것입니다. 사용 넓은​​을microcentrifuge 관에 신장을 배치 보어 전송 pipet. 신장 이제 원하는 연구를 기반으로 현장 유전자 발현 연구에 histological 또는 전체 마운트를 수행하기 위해 추가로 처리할 수 있습니다. 3. 대표 결과 : 그림 1 diagrammed하는 단계는 절개 절차를 나타냅니다. 그림 2에서와 같이 신장은 그 특성 모양과 착색, 그리고 동물의 뱃속의 지느러미 벽에 해부 위치에 따라 확인할 수 있습니다. 현장 하이브리드화에 고정 신장 샘플, 전체 마운트의 절개 후 그림 3과 같이, 관심 유전자의 표현을 집중하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1 : zebrafish 성인 신장을 해부에 대한 직접 액세스를 가능하게 절차. (A) Euthanized zebrafish는 연구자에게 완전한 신장 기관에 대한 쉬운 액세스를 제공하기 위해 (번호와 화살표로 표시) stepwise 방식으로 해부하는 것입니다. 복강의 이미지 이전 (B) 및 이후 (C) 복부 장기의 제거. 그림 2 :. 떼어낸 샘플에 zebrafish 신장의 시각화 뱃속에있는 장기에 따라 제거, 신장은 결합 조직 (A)를 통해 지느러미 몸 벽에 자기편이라고 하나, 평평 기관으로 나타나며, schematized되었습니다 (B)의 해부 학적 모양을 표시합니다. 그림 3 : 전체 성인의 신장 기관에서 수행 현장 hybridizations에서 전체 탑재합니다. (A) cadherin17 성적은 (A ')의 확대, 성인 신장 nephrons의 가느다란 관에 감지됩니다. (B) mafba의 성적표가 성인 신장 (패널의 전체 가느다란 관과 비교할 때)의 근위 nephron 세포 유형화된 있습니다. (B' ) mafba 표현의 확대는 성적이 특히 혈액 필터 (glomerulus)와 근위 뒤얽힌 가느다란 관 (PCT)의 podocyte (P) 세포화된 아르 보여줍니다.