アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

1。固定されていない動物のサンプルから大人のゼブラフィッシュの腎臓の解剖解剖のための年齢の3〜6ヵ月の間に大人のゼブラフィッシュを選択してください。 エラが動いて停止し、心臓が鼓動を停止することを確認して慎重に見て、約4-5分の0.2％Tricaine pH 7.0の皿にそれを置くことによって魚を安楽死させる。 スプーンを使用して、少量の溶液でTricaine槽から魚を持ち上げて、ソリューションをデカントし、軽くペーパータオル上で動物を置きます。 ちょうど鰓蓋（図1、パス）の後ろにカットをする、動物の頭を削除するには、解剖ハサミを使用してください。バイオハザード廃棄物容器の頭部を捨てる。 頭から開始し、尾鰭（図1、経路B）の基部にある尾で終了、長い腹側切開を行うことによって、動物の身体を開くために解剖鋏を使用してください。 解剖ピンセット/鉗子のペアを使用して、動物の内臓を外し、バイオハザード廃棄物の中に置いてください。これは腎臓の位置（図2）であるとして、背側体壁を磨くように注意してください。あなたがメスの魚を選択した場合は、最も簡単に鉗子やピンセットの角度のペアを使用して行うことができます体腔、の開発卵をかき出すする必要があります。 解剖トレイに体の壁を開きピン、および腎臓が可視化できるようにピンを角度に解剖針を使用してください。腎臓には黒い色のついた色素（図2）に散在して、特徴的な形状（頭部、トランク/サドル、テール）と色を持つようになる。また、臓器の構造の正中線を下に実行される末梢血で満たされた大動脈を、表示されることがあります。 あなたがそれを根底にある結合組織から臓器を分離するように腎臓を持ち上げるために鉗子の一組を使用して、背側体壁から腎臓をデタッチするには微細な鉗子を使用してください。 静かにそのようなFACSの調製のための1X PBSを含むマイクロチューブのようなさらに、生細胞の研究、のために必要な車両に腎臓を置きます。 2。固定動物サンプルから大人のゼブラフィッシュの腎臓の準備と解剖 4パーセントparaformaldehyde/1XのPBSTの溶液を調製します。溶液中にPFAを溶解するためのソリューションを沸騰させて、その後4℃に混合物を冷却し、0.1％ジメチルスルホキシドを追加します。我々は、冷凍アリコートとは対照的にたてPFAのソリューションを使用してから組織保存で最も成功を収めている。水没解剖時の大人ゼブラフィッシュのに十分なソリューションとなります。 水没解剖時の大人ゼブラフィッシュのに十分な固定液で解剖トレイを埋める。我々は、固定の匂いへの曝露を最小限に抑えるために、化学フードに置くことができる顕微鏡下に置かこのトレイ、後続の手順を実行します。 解剖のための年齢の3〜6ヵ月の間に大人のゼブラフィッシュを選択してください。 エラと心臓の停止が鼓動ことを確認して慎重に見て、約5分間の0.2％Tricaine pH 7.0の皿にそれを置くことによって魚を安楽死させる。 スプーンを使用して、少量の溶液でTricaine槽から魚を持ち上げて、ソリューションをデカントし、軽くペーパータオル上で動物を置きます。 ちょうど鰓蓋（図1、パス）の後ろにカットをする、動物の頭を削除するには、解剖ハサミを使用してください。バイオハザード廃棄物容器の頭部を破棄し、そして即座にPFA含有解剖トレイに動物を配置。 頭から開始し、尾鰭（図1、経路B）の基部に尾で終了する、長い腹側切開を行うことによって、動物の身体を開くために解剖鋏を使用し、そして部分的に中に没水体を維持する手続き。 解剖ピンセット/鉗子のペアを使用して、動物の内臓を外し、バイオハザード廃棄物の中に置いてください。これは腎臓の位置（図2）であるとして、背側体壁を磨くように注意してください。 体の壁を開放ピン、および腎臓が可視化できるようにピンを角度に解剖針を使用してください。腎臓には黒い色のついた色素（図2）に散在して、特徴的な形状（ヘッド、サドル、テール）と色を持つようになる。また、臓器の構造の正中線を下に実行される末梢血で満たされた大動脈を、表示されることがあります。 4 ° Cあなたが希望するサンプルのアレンジで行われている時にトレイを置き、一晩サンプルを修正。 翌日、トレイからPFA液を除去し、1 × PBSTで交換してください。 慎重にあなたがそれを根底に、結合組織から臓器を分離するように腎臓を持ち上げるために鉗子の一組を使用して、背側体壁から腎臓をデタッチするには微細な鉗子を使用してください。腎組織は、それが可能な一体で全体の腎臓の臓器を分析すること、固定液中のDMSOから柔らかく、しなやかになります。 使用して、ワイドをマイクロ遠心チューブに腎臓を配置するボア転送ピペット。 腎臓は、今必要な調査に基づいて、 その場の遺伝子発現研究に組織学的または全体のマウントを行うためにさらに処 ​​理することができます。 3。代表的な結果： 図1に図示されている手順では、解剖の手順を示している。図2に示すように、腎臓は、その特徴的な形と色合い、そして動物の体腔の背壁に解剖学的位置に基づいて識別することができます。固定腎標本の解剖した後、in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、図3に示すように、目的の遺伝子の発現をローカライズするために使用することができます。 図1：ゼブラフィッシュ成体の腎臓を解剖するためのダイレクトアクセスを可能にする手順。 （A）安楽死ゼブラフィッシュは、研究者に完全な腎臓の臓器への簡単なアクセスを与えるために（数字と矢印で示される）段階的に解剖されています。腹腔内の画像の前に（B）と後（C）腹部臓器の除去。 図2：固定されていないサンプルのゼブラフィッシュ腎臓の可視化は、体腔内の臓器の除去に続いて、腎臓は、結合組織を介して背側体壁（）への付着である単一の統合器官として表示され、図式されています（B）、その解剖学的形状を示す。 図3：全体の成人の腎臓の臓器で実行サイチュハイブリダイゼーションの全マウント。 （）cadherin17転写物は、（'）で拡大し、成人の腎臓のネフロンの尿細管で検出されています。（B）mafbaの転写物が（パネル全体この中で尿細管と比較）成人腎臓における近位ネフロンの細胞型をローカライズしている。（B' ）mafba 式の拡大図は、その転写物は、特に血液フィルター（糸球体）と近位尿細管（PCT）の足細胞（P）を細胞に局在していることを示します。